生物化學與分子生物學/其他實驗技術/石蠟切片(蘇木精-伊紅對染法)

實驗原理

石蠟切片是最基本的切片技術，冰凍切片和超薄切片等都是在石蠟切片基礎上發展起來的。蘇木素與伊紅對比染色法（簡稱H.E.對染法）是組織切片最常用的染色方法。這種方法適用範圍廣泛，對組織細胞的各種成分都可着色，便於全面觀察組織構造，而且適用於各種固定液固定的材料，染色後不易褪色可長期保存。經過HE染色，細胞核被蘇木素染成藍紫色，細胞質被伊紅染色呈粉紅色。

器材及試劑

器材

切片刀，切片機，恆溫箱，蠟杯，酒精燈，解剖刀，解剖剪，解剖盤，培養皿，鑷子，單面刀片，毛筆，包埋盒，染色缸，蓋玻片，載玻片，玻片盤，樹膠，樹膠瓶，顯微鏡，溫度計，臉盆，水浴鍋。

切片機，切片刀，溫台，恆溫箱，解剖刀，鑷子，剪刀，解剖針，單面刀片，小台木，灑精燈，包埋紙盒，染色缸，燒杯，水盆，熔蠟爐，蠟杯。

試劑

中性福爾馬林固定液、各種濃度的酒精、二甲苯、石蠟、蜂蠟、蘇木精染液， 1%伊紅酒精溶液，1%鹽酸酒精溶液，甘油蛋白粘片劑，中性樹膠。

卡諾（Carnoy）固定液，埃利希蘇木精染液，1%伊紅酒精溶液，1%鹽酸乙醇液，各級酒精（30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%），二甲苯，甘油蛋白粘片劑，中性樹膠。

材料

鼠肝、腎、心肌、骨骼肌或其他組織、大豆或小麥、綠豆、洋蔥、大蒜、蠶豆的根、莖、葉等。

試劑配法

中性甲醛固定液：

甲醛（37%-40%，市售，本所購買即為此濃度） 100mL

磷酸氫二鈉 6.5

磷酸二氫鉀（鈉） 4g

雙蒸水 900mL

蘇木精、伊紅染色液為碧雲天產品

1%鹽酸乙醇液

鹽酸 1份

70%酒精 100份

甘油蛋白貼片劑：

蛋白 50 ml

甘油 50 ml

水楊酸鈉（防腐劑） 1g

配製時將雞蛋一個打破入碗或杯中，去蛋黃留下蛋白，用玻棒調打成雪花狀泡沫，然後用粗紙或雙層紗布過濾到量筒中，經數小時或一夜，即可濾出透明蛋白液。此時在其中再加等量的甘油，稍稍振搖使兩者混合。最後加入防腐劑（水楊酸鈉）作防腐用。可保存幾個月。

實驗步驟

取材

頸椎脫臼法處死小鼠，打開腹腔，剪取肝組織（或其他組織）。

切取的組織塊不宜太大，以利於固定劑穿透，通常以5mm×5mm×2mm或10 mm×10 mm×2 mm為宜。取下所需要的肝組織，切成一小塊2－3mm厚。

注意事項

取材動作要迅速，不宜作太久的拖延以免組織細胞的成分、結構等發生變化。
切片材料應根據需要觀察的部位進行選擇，儘可能不要損傷所需要的部分。

固定

將切好的肝組織用生理鹽水組織洗一下，立即投入中性福爾馬林固定液中固定，固定30－50min。

注意事項

一般固定液，都以新配為好，配好後應貯存在陰涼處，不宜放在日光下，以免引起化學變化，失去固定作用。
有些混合固定液的成份之間會發生氧化還原作用，一定要在使用前才混合，如果混合太早，固定時就沒有作用了。
固定材料時，固定液必須充足，一般為材料塊的20~30倍，有些水分多的材料，中間應更換1-2次新液。
材料固定完畢後，保存於嚴密緊塞或加蓋的容器里，同時在容器外上標籤，並隨同材料在溶液中投入相應的標籤，以免相互混淆。標籤上註明固定液、材料來源、日期等。標籤上的文字，應用黑色鉛筆或繪圖黑墨水書寫。

洗滌

材料經固定後,流水沖洗，數小時或過夜。

脫水

材料依次經70%、80%、90%各級乙醇溶液脫水，各30min，再放入95%、100%各2次，每次20min。各

注意事項

脫水必須在有蓋的玻璃品中進行，防止吸收空氣中的水分。
在更換高一級的脫水劑時，最好不要移動材料以免損壞，可用吸管吸出器皿中的脫水劑，再用吸水吸盡器皿內剩餘液，然後於皿中加入高一級脫水劑。
在低濃度酒精中，每級停留不宜太長，否則易使組織變軟，助長材料的解體。
在高濃度或純酒精中，每級停留的時間也不宜太長，否則會使組織變脆，影響切片。
如需過夜，應停留在70%酒精中。
脫水必須徹底，否則不易透明，甚至使透明劑內出現白色混濁現象

透明

純酒精、二甲苯等量混合液15min，二甲苯Ⅰ15min、Ⅱ15min（至透明為止）。

由於乙醇與石蠟不相溶，而二甲苯既能溶於乙醇又能溶於石蠟，所以脫水後還要經過二甲苯以過渡。當組織中全部被二甲苯佔有時，光線可以透過，組織呈現出不同程度的透明狀態。

透明注意事項

使用透明劑時，要隨時蓋緊蓋子，以免空氣中的水分進入。
更換每級透明劑，動作要迅速，一方面為了不使材料塊乾涸，另一方面能避免吸收濕氣。
在透明過程中，如果材料周圍出現白色霧狀，說明材料中的水未被脫淨，應退回純酒精中重新脫水，然後再透明。

透蠟

放入二甲苯和石蠟各半的混合液15min，再放入石蠟Ⅰ、石蠟Ⅱ透蠟各50-60分鐘。

透蠟的目的是除去組織中的透明劑（如二甲苯等），使石蠟滲透到組織內部達到飽和程度以便包埋。透蠟時間根據組織大小而定。透蠟應在恆溫箱內進行，並保持箱內溫度在55-60℃左右，注意溫度不要過高，以免組織發脆。一般置於恆溫箱0.5h。

透蠟注意事項

儘量保持在較低溫度中進行，以石蠟不凝固為度；
透蠟溫度要恆定，不可忽高忽低；
操作要迅速，力求在最短的時間內完成石蠟透入過程，以免引起組織變硬、變脆、收縮等。

包埋

包埋時，用鑷子夾取石蠟模子（金屬質地）在酒精燈上稍加熱，放在平的桌面上，從溫箱中取出盛放純石蠟的蠟杯，倒入少許石蠟。再將鑷子在酒精燈上稍加熱，夾取材料將切面朝下放入蠟模中，排列整齊。再放上包埋盒，輕輕倒入熔蠟。

切片

①將已固定和修好的石蠟塊裝在切片機的夾物台上。

②將切片刀固定在刀夾上，刀口向上。

③搖動推動螺旋，使石蠟塊與刀口貼近，但不可超過刀口。

④調整石蠟塊與刀口之間的角度與位置，刀片與石蠟切片約成15度左右。

⑤調整厚度調節器到所需的切片厚度，一般為4-10微米。

⑥一切調整好後主可以開始切片。此時右手搖動轉輪，讓蠟塊切成蠟帶，左手持毛筆將蠟帶提起，搖轉速度不可太急，通常以40-50r/min。

⑦切成的蠟帶到20-30cm長時，右手用另一支毛筆輕輕將蠟帶挑起，以免捲曲，並牽引成帶，平放在蠟帶盒上，靠刀面的一面較光滑，朝下，較皺的一面朝上。

⑧用單面刀片切取蠟片一小段，放在載玻上加水一滴，置於放大鏡或顯微鏡下觀察切片是否良好。

⑨切片工作結束後，應將切片刀取下用氯仿擦去刀上沾着的石蠟，把切片機擦拭乾淨妥為保存。

展片、貼片

打開水浴鍋，使水溫維持在40-45℃，另準備30%乙醇溶液。

① 切片時，將一碗30%乙醇溶液放於切片機旁的桌面上。

② 用小鑷子夾取預先用刀片割開的蠟帶，放在乙醇溶液的水面上，使切片展開。

③小鑷子輕輕地將連在一起的切片分開，用一個載玻片將切片完整，已展開的切片撈至溫水中，使之充分展開。

④ 另取潔淨的載玻片，撈起展開的切片，使其位於切片1/3處，另一端（磨邊，粗糙的一端）磨麵上標記或貼上標籤，放於切片架上。

脫蠟復水

將水浴鍋溫度調至60℃，待水溫控制在60℃時，將切片連同切片架放入一乾燥的染色缸內，放入水浴鍋中，蓋上蓋子（可密封），30min至蠟熔化。

之後，石蠟切片經二甲苯Ⅰ、Ⅱ脫蠟各5min，然後放入100%、95%、90%、80%、70%各級酒精溶液中各3-5min，再放入蒸餾水中3min。

染色

切片放入蘇木精中染色約10-30min。

染色時間應根據染色劑的成熟程度及室溫高低，適當縮短或延長。室溫高時促進染色，染色時間可短些，否則可適當延長時間，冬季室溫低時可放入恆溫箱中染色。

水洗

用自來水流水沖洗約15min。使切片顏色變藍（或放入鹼性水中也可），但要注意流水不能過大，以防切片脫落。

分化

將切片放入1%鹽酸乙醇液中褪色，約2秒至數十秒鐘。見切片變紅，顏色較淺即可。

漂洗

切片再放入自來水流水中使其恢復藍色。

脫水Ⅰ

切片入50%乙醇→70%乙醇→80%乙醇中各3-5min。

復染

用0.5%伊紅乙醇液對比染色1-3min。

伊紅主要染細胞質，着色濃淡應與蘇木精染細胞核的濃淡相配合，如果細胞核染色較濃，細胞質也應濃染，以獲得鮮明的對比。反之，如果細胞核染色較淺，細胞質也應淡染。可在伊紅乙醇液中滴加數滴冰醋酸助染，促使細胞質容易着色，並且經乙醇脫水時不易褪色。

脫水Ⅱ

將切片放入95%乙醇中洗去多餘的紅色，然後放入無水乙醇中3-5min。最後用吸水紙吸乾多餘的乙醇。

透明

切片放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ中各3-5min。

二甲苯應儘量保持無水，應經常更換，或用紗布包無水硫酸銅放入染色缸內吸收水分。切片如在二甲苯中出現白霧現象，說明脫水未盡，應退回乙醇中重新脫水，否則切片難以鏡檢。

封藏：中性樹膠封存

因切片經二甲苯透明，使用中性樹膠作為封藏劑，樹膠可用二甲苯稀釋至合適的稠度。

封藏的方法

封片前應根據材料的大小，選用不同規格的蓋玻片。材料透明後，在桌上放一張潔淨的吸水紙，將含材料的載玻片從二甲苯中取出放在紙上（切片的一面向上），迅速地在切片的中央滴一滴樹膠（千萬不能待二甲苯乾燥後再進行），用右手持小鑷子輕輕地夾住蓋玻片的右側，稍為傾斜使其左側與封藏劑接角，然後再緩慢地將蓋玻片放下，這樣就可以減少或避免產生氣泡。如膠液不足，可以用玻棒再滴一滴樹膠從蓋玻片邊緣補足。如膠液過多，可在乾燥以後用刀刮去，並用紗布蘸二甲苯拭去殘留的樹膠。

染色結果：細胞核被蘇木素染成藍色，細胞質被伊紅染色呈粉紅色。