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生物化学与分子生物学/PCR实验技术/PCR产物的TA克隆

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实验原理

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  1. DNA片段回收方法：DNA片段在适当浓度的琼脂糖凝胶中，通上一定电压进行电泳，不同大小的DNA分子由于迁移率的不同而分离开。切下带有所需DNA片段的凝胶，用冻融法、玻璃奶回收法或商品化胶回收试剂盒将目的片段回收纯化。
  2. 利用Taq酶能够在PCR产物的3’末端加上一个非模板依赖的A，而T载体是一种带有3’T突出端的载体，在连接酶作用下，可以把PCR产物插入到质粒载体的多克隆位点，可用于PCR产物的克隆和测序。

商品化的T载体有很多。本实验采用TaKaRa公司的pMDTM18-T Simple Vector。这个载体以pUC19载体为基础，消除了pUC18载体上的多克隆酶切位点，经EcoRⅤ酶切后在两侧的3＇端添上“T”制备而成（见附录1）。由于本载体上消除了多克隆酶切位点，克隆后的PCR产物将无法使用载体上的限制酶切下，需要在PCR扩增引物上导入合适的酶切位点。

试剂与器材

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试剂

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  1. pMDTM18-T Simple Vector Kit（Takara公司）。
  2. TAE电泳缓冲液
  3. 琼脂糖（Agarose）
  4. 6×电泳加样缓冲液：0.25％ 溴粉蓝，40％(w/v) 蔗糖水溶液，贮存于 4℃。
  5. 溴化乙锭(EB)溶液母液：配制成10mg/mL，用铝箔或黑纸包裹容器，储于室温即可。
  6. 70%乙醇
  7. 胶回收试剂盒（Omega公司）

器材

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水平式电泳装置,电泳仪,台式高速离心机, 恒温水浴锅, 微量移液枪, 微波炉或电炉,紫外透射仪, 凝胶成像系统或其它照相设备。

操作方法

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胶回收试剂盒回收PCR产物（以Omega公司 Gel Extraction Kit为例）

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  1. 当目的片段DNA完全分离时，转移凝胶至紫外灯上尽可能快地切下目的片段。
  2. 凝胶块转移至1.5ml离心管(离心管已经称重了)中，称重得出凝胶块的重量。近似地确定其体积（假设其密度为1g/ml）。加入等体积的Binding Buffer（XP2），于55-65℃水浴中温浴7min或至凝胶完全融化，每2-3 min振荡混合物。（在凝胶完全溶解之后，注意凝胶-Binding buffer混和物的pH值。如果其pH值大于8的话，DNA的产量将大大减少。如果是橙色或红色，则要加入5μl 浓度为5 M，pH为5.2的醋酸钠，以调低其pH值。该混合物的颜色将恢复为正常的浅黄色。）
  3. 取一个干净的HiBind DNA Mini柱子装在一个干净的2ml收集管内（已备好）。
  4. 将第三步获得的DNA/熔胶液全部转移至柱子中。室温下10,000 x g离心1分钟。弃收集管中的滤液，将柱子套回2ml收集管内收集管。
  5. 如果DNA/凝胶熔液的体积超过700ul，一次只能转移700ul至柱子中，余下的可继续重复第5步至所有的溶液都经过柱子。每一个Hibind DNA回收纯化柱都有一个极限为25μg DNA的吸附能力。如果预期产量较大，则把样品分别加到合适数目的柱子中。
  6. 弃收集管中的滤液，将柱子套回2ml收集管内收集管。转移300μl Binding Buffer（XP2）至柱子中，室温下， 10,000 x g下离心1min。
  7. 弃收集管中的滤液，将柱子套回2ml收集管内收集管。转移700μl SPW Wash buffer（已用无水乙醇稀释的）至柱子中。室温下10,000xg离心1min。（浓缩的SPW Wash Buffer在使用之前必须按标签的提示用乙醇稀释。如果DNA洗涤缓冲液在使用之前是置于冰箱中的，须将其拿出置于室温下）。
  8. 重复用700μl SPW Wash buffer洗涤柱子。室温下10,000xg离心1min。
  9. 弃收集管中的滤液，将柱子套回2ml收集管内收集管。室温下,13,000 x g离心2 min以甩干柱子基质残余的液体。
  10. 把柱子装在一个干净的1.5ml离心管上，加入15~30μl（具体取决于预期的终产物浓度）的Elution Buffer(或TE缓冲液)到柱基质上，室温放置1min, 13,000xg离心1min以洗脱DNA。第一次洗脱可以洗出70-80%的结合DNA。 如果再洗脱一次的话，可以把残余的DNA洗脱出来，不过那样的浓度就会较低。

连接反应（以Takara公司pMDTM18-T Simple Vector Kit为例）

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  • 在微量离心管中配制下列DNA溶液，全量为5 μl。
pMDTM18-T Simple Vector 1 μl
Insert DNA 0.1 pmol～0.3 pmol
dH2O up to 5 μl
  • 加入5 μl（等量）的 Solution I。  
  • 16℃反应30分钟。（2 kbp以上长片段PCR产物进行DNA克隆时，连接反应时间请延长至数小时）。
  • 全量（10 μl）加入至100 μl 感受态细胞中，冰中放置30分钟。
  • 42℃加热45秒钟后，再在冰中放置1分钟。
  • 加入890 μl LB培养基，37℃振荡培养60分钟。
  • 在含有X-Gal、IPTG、Amp的LB琼脂平板培养基上培养，形成单菌落。计数白色、蓝色菌落。
  • 挑选白色菌落，鉴定载体中插入片段的长度大小。

注意事项与提示

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  1. 使用新鲜的电泳缓冲液TAE Buffer。不要重复使用，其PH的升高会减少产量。
  2. 不论采取何种方法回收DNA，在回收过程中，要尽量减少洗脱体积，以便提高收得率和浓度，以方便后续操作。
  3. 从胶上回收DNA时，应尽量缩短光照时间并采用长波长紫外灯(300-360nm)，以减少紫外光对DNA的切割。DNA曝露在紫外灯下不能超过30秒。
  4. 连接反应时间是与温度密切相关，因为反应速度随温度的提高而加快。通常可采用16℃连接4小时为宜，如是平端连接需要适当延长反应时间以提高连接效率；在选择反应的温度与时间关系时，也要考虑在反应系统中其他因素的影响。
  5. 连接反应的整个过程应注意枪头的洁净以避免造成对酶的污染，为防止酶活性降低，取酶时应在冰上操作且动作迅速。
  6. 连接反应应在25℃以下进行，温度升高较难形成环状DNA，影响连接效率。长片段PCR产物（2kb以上）进行连接时，连接反应时间应延长至数小时。
  7. 进行克隆时，Vector DNA和Insert DNA的摩尔数比一般为1:2~10。根据实验情况选择合适的摩尔数比。
  8. 用高效的感受态细胞（转化效率≥1×108 cfu/μg pUC19），这样才可能得到比较理想的阳性克隆。
    • 转化效率的计算：取0.1 ng的pUC19 Plasmid DNA加入至100μl的感受态细胞中后，再加入900 μl 的LB培养基(0.1 ng DNA/ml)，将上述培养液稀释10倍后(0.01 ng DNA/ml) 。
    • 取100 μl涂布平板(0.001 ng DNA/100 μl)，记录菌落数。以得到200个克隆体为例计算转化效率，此时的转化效率=200 cfu/0.001 ng=2x105 cfu/ng=2x108 cfu/μg pUC19 DNA。
  9. 试剂盒配有Control DNA。通过对照实验判断试剂盒的保存效果。

实验报告要求与思考题

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1．PCR产物的T-vector克隆方法，应注意哪些操作环节？

2．和其他组结果比较，对本组实验结果进行分析。

3．对于用高保真Taq DNA聚合酶扩增的PCR产物，如何进行克隆？

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