生物化学与分子生物学/抑癌基因

癌基因和抑癌基因 - 癌基因 - 抑癌基因
抑癌基因也称肿瘤抑制基因(tumor suppressor gene) , 是防止或阻止癌症发生的基因。与原癌基因活化诱发癌变的作用相反，抑癌基因的部分或全部失活可显著增加癌症发生风险。抑癌基因对细胞增殖起负性调控作用，包括抑制细胞增殖、调控细胞周期检查点、促进凋亡和参与 DNA损伤修复等。

抑癌基因对细胞增殖起负性调控作用

抑癌基因的发现源于20世纪60年代H.Harris的杂合细胞致癌性研究。他将癌细胞株与正常细胞融合得到的杂合细胞接种动物，发现并不产生肿瘤，提示正常细胞中有能抑制肿瘤发生的基因，即抑癌基因。用化学物质诱发的肿瘤及自发发生的肿瘤的细胞与正常细胞制备杂合细胞也可重复出上述结果，并且与肿瘤的组织起源无关，表明上述结果有普遍意义。将不具致癌性的杂合细胞体外培养传代，可从中分离出具有致癌性的子代细胞。比较两种杂合细胞，发现致癌性的子代杂合细胞丢失了来自正常细胞的一条或几条染色体。将正常人类细胞的单条染色体逐一融合在肿瘤细胞中，也可分离到无致癌性的杂合细胞。这些结果说明细胞中含有各种不同的抑癌基因，分布在不同的染色体上，可以分别抑制不同组织起源的癌细胞的致癌作用。
随着20世纪70年代基因克隆技术的建立，RB、TP53等一系列抑癌基因得以克隆和鉴定。必须指出，最初在某种肿瘤中发现的抑癌基因，并不意味其与别的肿瘤无关；恰恰相反，在多种组织来源的肿瘤细胞中往往可检测出同一抑癌基因的突变、缺失、重排、表达异常等，这正说明抑癌基因的变异构成某些共同的致癌途径。总体来说，抑癌基因对细胞增殖起负性调控作用，其编码产物的功能有：抑制细胞增殖；抑制细胞周期进程；调控细胞周期检查点；促进凋亡；参与DNA损伤修复。

抑癌基因有多种失活机制

抑癌基因的失活与原癌基因的激活一样，在肿瘤发生中起着非常重要的作用。但癌基因的作用是显性的，而抑癌基因的作用往往是隐性的。原癌基因的两个等位基因只要激活一个就能发挥促癌作用，而抑癌基因则往往需要两个等位基因都失活才会导致其抑癌功能完全丧失。1971年，Knudson A以视网膜母细胞瘤(retinoblastoma)为模型进行统计学分析研究，发现散发性单侧视网膜母细胞瘤的发病需要抑癌基因（即后来命名为RB的基因）的两次体细胞突变，从而提出二次打击假说(two-hit hypothesis)。
但也有一些抑癌基因只失活其等位基因中的一个拷贝就会引起肿瘤发生，即其一个正常的等位基因拷贝不足以完全发挥其抑癌功能，称为单倍体不足型抑癌基因(haploinsufficient tumor suppressor gene), 如p27^Kipl基因。还有一些抑癌基因，如TP53基因，当其一个等位基因突变失活后，其表达的 p53突变蛋白则能抑制另一个正常等位基因产生的野生型即正常p53蛋白的功能，这种基因突变称为显性负效突变(dominant negative mutation)。
抑癌基因失活的方式常见有以下三种。

基因突变常导致抑癌基因编码的蛋白质功能丧失或降低

抑癌基因发生突变后，会造成其编码的蛋白质功能或活性丧失或降低，进而导致癌变。这种突变属于功能失去突变(loss-of-function mutation)。最典型的例子就是抑癌基因TP53的突变，目前已经发现TP53基因在超过一半以上的人类肿瘤中发生了突变。

杂合性丢失导致抑癌基因彻底失活

杂合性(heterozygosity)是指同源染色体在一个或一个以上基因座存在不同的等位基因的状态。杂合性丢失(loss of heterozygosity, LOH)则是指一对杂合的等位基因变成纯合状态的现象。杂合性丢失是肿瘤细胞中常见的异常遗传学现象，发生杂合性丢失的区域也往往就是抑癌基因所在的区域。
杂合性丢失导致抑癌基因失活的经典实例就是抑癌基因RB的失活。1986年，将视网膜母细胞瘤的RB基因成功克隆后就发现，RB等位基因的一个拷贝往往是通过生殖细胞突变遗传给后代，也就是说，此时后代的体细胞中RB等位基因就呈现为杂合子状态，即：一个为突变失活的不具有抑癌功能的RB等位基因，另一个为仍具有抑癌功能的正常RB等位基因。而当因为某些原因导致正常的RB等位基因丢失即杂合性丢失时，抑癌基因RB则彻底失活，失去其抑癌作用，从而导致视网膜母细胞瘤。

启动子区甲基化导致抑癌基因表达抑制

真核生物基因启动子区域CpG岛的甲基化修饰对于调节基因转录活性至关重要，甲基化程度与基因表达呈负相关。很多抑癌基因的启动子区CpG岛呈高度甲基化(hypermethylation)状态，从而导致相应的抑癌基因不表达或低表达。例如，约70%的散发肾癌病人中存在抑癌基因VHL启动子区甲基化失活现象；在家族性腺瘤息肉所致的结肠癌中，APC基因启动子区因高度甲基化使转录受到抑制，导致APC基因失活，进而引起仕连环蛋白在细胞内的积累，从而促进癌变发生。

抑癌基因在肿瘤发生发展中具有重要作用

抑癌基因的失活在肿瘤发生发展中发挥着重要作用，此处以TP53、RB、PTEN三个抑癌基因为例，简要介绍抑癌基因的作用机制。

RB主要通过调控细胞周期检查点而发挥其抑癌功能

RB基因失活不仅与视网膜母细胞瘤及骨肉瘤有关，在许多散发性肿瘤，如50%～85%的小细胞性肺癌、10%～30%乳腺癌、膀胱癌和前列腺癌中都发现有RB基因失活。
RB基因位于染色体13q14, 有2 7个外显子，mRNA长 4.7kb, 编码的蛋白质为105kD。RB蛋白的磷酸化状态及其与其他蛋白质结合，与它的功能密切相关。去磷酸化（或低磷酸化）形式为活性型，能促进细胞分化，抑制细胞增殖。实验表明，将RB基因导入视网膜母细胞瘤细胞或成骨肉瘤细胞，这些恶性细胞的生长受到抑制。
RB的磷酸化程度受细胞周期中增殖调控蛋白质的直接控制，包括随着细胞周期不同时相的转换，其浓度也随之发生变化的细胞周期蛋白(cyclin) , 以及受到这些蛋白质调节的蛋白激酶。这些蛋白激酶被称为细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependent kinase , CDK)。细胞进入G₁期时RB处于低磷酸化状态，而低磷酸化的RB使得细胞不能通过G₁/S期检查点(checkpoint)。该检查点是哺乳动物细胞周期的重要检查点，只有通过该检查点后，细胞周期才能进入下一步运转，进行DNA合成和细胞分裂，故又称为限制点(restriction point) , 以符号"R"表示。只有在细胞增殖信号通过依赖于cyclin D1的激酶CDK4的活化导致RB磷酸化后，高磷酸化的RB方允许细胞跨过G₁/S期检查点。因此，低磷酸化的RB在G₁期特异的磷酸化是细胞从G₁期进入S期的关键。
低磷酸化RB对细胞周期的负调节作用是通过与转录因子E2F-l的结合而实现的。低磷酸化RB的口袋结构域能结合E2F-l并使之失活，S期必需的基因产物如二氢叶酸还原酶、胸苷激酶、 DNA聚合酶α等的合成因而受限，细胞周期的进展受到抑制。而高磷酸化的RB不能与E2F-l结合，将导致这些基因的开放，促进细胞通过G_l-S关卡。RB基因的缺失使得细胞丧失了该关卡的“守卫”，细胞周期进程失控，细胞异常增殖。

TP53主要通过调控DNA损伤应答和诱发细胞凋亡而发挥其抑癌功能

TP53基因是目前研究最多的、也是迄今发现在人类肿瘤中发生突变最广泛的抑癌基因。50%～60%的人类各系统肿瘤中发现有TP53基因突变。
人的TP53基因定位于17pl3,全长16～20kb, 含有11个外显子，转录2.8kb的mRNA,编码蛋白为p53,具有转录因子活性。TP53基因是迄今为止发现的与人类肿瘤相关性最高的基因。过去一直把它当成一种癌基因，直至1989年才知道起癌基因作用的是突变的p53,后来证实野生型p53是一种抑癌基因。
TP53基因的表达产物p53蛋白由393个氨基酸残基构成，在体内以四聚体形式存在。p53蛋白属于转录因子，包含有典型的转录激活结构域、DNA结合结构域、寡聚结构域、富含脯氨酸区和核定位序列等多个结构域或序列，这也是 p53发挥其生物学功能的分子结构基础。多数TP53基因突变都发生在编码其DNA结合结构域的序列中。
正常情况下，细胞中p53蛋白含量很低，因其半衰期只有20～30分钟，所以很难检测出来，但在细胞增殖与生长时，可升高5～100倍以上。野生型 p53蛋白在维持细胞正常生长、抑制恶性增殖中起着重要作用，因而被冠以“基因组卫士”称号。当细胞受电离辐射或化学试剂等作用导致DNA损伤时，p53表达水平迅速升高，同时p53蛋白中包含的一些丝氨酸残基被磷酸化修饰而被活化。活化的p53从细胞质移位至细胞核内，调控大量下游靶基因的转录而发挥其生物学功能。例如，p53的靶基因之一p21 可阻止细胞通过G₁/S期检查点，使其停滞于G期；另一靶基因GADD45 的产物是DNA修复蛋白。这就使DNA受损的细胞不再分裂，并且修复损伤以维持基因组的稳定性。如果修复失败，p53蛋白就会通过激活一些靶基因如BAX 的转录而启动细胞凋亡，阻止有癌变倾向突变细胞的生成。p53突变后，则DNA损伤不能得到有效修复并不断累积，导致基因组不稳定，进而导致肿瘤发生。

PTEN主要通过抑制Pl3K/AKT信号通路而发挥其抑癌功能

PTEN基因(phosphatase and tensin hornolog deleted on chromosome ten gene, 第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基基因）是继TP53基因后发现的另一个与肿瘤发生关系密切的抑癌基因。人的PTEN 基因定位于10q23.3, 共有9个外显子和8个内含子，编码5.15kb的mRNA，PTEN蛋白由403个氨基酸残基组成，分子量约为56kD。PTEN主要包括3个结构功能域。

N端磷酸酶结构区 由N端1～185位氨基酸残基组成，第5外显子编码，与蛋白酪氨酸磷酸酶及蛋白质丝／苏氨酸磷酸酶催化区的核心模体(HCXXGXGRXG)同源，是PTEN发挥肿瘤抑制活性的主要功能区。PTEN的N-端175个氨基酸序列可与整合素、酪氨酸激酶、黏着斑激酶(focaladhesion kinase, FAK)等形成复合物，共同参与细胞生长的调节。此外，PTEN还能与肌动蛋白纤维细丝局部黏附，在肿瘤浸润、转移、血管生成中也起一定作用。
C2区 由186～351位氨基酸残基构成，介导蛋白质与脂质的结合。PTEN通过C2区结合于膜磷脂，参与PTEN在胞膜的有效定位和胞内细胞信号转导。与其他信号蛋白不同，这一结合过程不需要Ca²⁺参与。磷酸酶区和C2区之间有广泛的相互作用界面，提示C2区可能具有催化作用。已有实验证实，对C2区进行诱变，可导致PTEN的肿瘤抑制活性降低。
C端区 由羧基端的50个氨基酸残基组成，包括PDZ(PSD-95/Dlg/ZOI同源区）结合序列(Thr/Ser-X-Val-COOH)和2个PEST序列(350～375,376～396), 对于调节自身的稳定性和酶活性具有重要作用。研究表明PEST序列与蛋白质降解有关，PDZ结合位点与细胞生长调控有关。PDZ区在肿瘤的发生中也可以缺失突变，虽不影响磷酸酶功能，但对肿瘤细胞锚定非依赖性生长的抑制作用显著降低。

PTEN 是迄今发现的第一个具有双特异(dual specificity)磷酸酶活性的抑癌基因，其编码产物 PTEN具有磷脂酰肌醇-3,4 ,5-三磷酸 3-磷酸酶活性，催化水解磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸 (PIP₃)的 3-磷酸成为PIP₂,而 PIP₃是胰岛素、表皮生长因子等细胞生长因子的信号转导分子，从而抑制 PI3K/AKT信号通路，起到负性调节细胞生长增殖的作用。PTEN也能催化黏着斑激酶(focal adhesion kinase, FAK)的去磷酸化反应，而抑制由整联蛋白(integrin)介导的细胞铺展和迁移，因而PTEN的失活也与肿瘤细胞的转移密切相关。

肿瘤发生发展涉及癌基因和抑癌基因的共同参与

目前普遍认为肿瘤的发生、发展是多个原癌基因和抑癌基因突变累积的结果，经过起始、启动、促进和癌变几个阶段逐步演化而产生。

肿瘤发生发展涉及多种相关基因的改变

在基因水平上，或通过外界致癌因素，或由于细胞内环境的恶化，突变基因数目增多，基因组变异逐步扩大；在细胞水平上则要经过永生化、分化逆转、转化等多个阶段，细胞周期失控细胞的生长特性逐步得到强化。结果是相关组织从增生、异型变、良性肿瘤、原位癌发展到浸润癌和转移癌。例如，结肠癌的发生发展过程涉及数种基因的变化: ①上皮细胞过度增生阶段：涉及家族性腺瘤性息肉基因FAP(familial adenomatous polyposis)、结肠癌突变基因MCC(mutated in colorectal carcinoma)的突变或缺失；②早期腺瘤阶段：与DNA的低甲基化有关；③中期腺瘤阶段：涉及K-RAS 基因突变；④晚期腺瘤阶段：涉及结肠癌缺失基因DCC的丢失；⑤腺癌阶段：涉及TP53 基因缺失；⑥转移癌阶段：涉及NM23(nonmetastatic protein 23)基因的突变、血管生长因子基因表达增高等。

细胞周期和细胞凋亡的分子调控是肿瘤进展的关键

1、原癌基因和抑癌基因是调控细胞周期进程的重要基因 细胞周期调控体现在细胞周期驱动和细胞周期监控两个方面，后者的失控与肿瘤发生发展的关系最为密切。细胞周期监控机制由DNA损伤感应机制、细胞生长停滞机制、DNA修复机制和细胞命运决定机制等构成。细胞一旦发生DNA 损伤或复制错误，将会启动DNA损伤应激机制，经由各种信号转导途径使细胞停止生长，修复损伤的DNA。如果DNA损伤得到完全修复，细胞周期可进入下一个时相，正常完成一个细胞分裂周期；倘若DNA损伤修复失败，细胞凋亡机制将被启动，损伤细胞进入凋亡，从而避免DNA损伤带到子代细胞，维持了组织细胞基因组的稳定性，避免肿瘤发生的潜在可能。
肿瘤细胞的最基本特征是细胞的失控性增殖，而失控性增殖的根本原因就是细胞周期调控机制的破坏，包括驱动机制和监控机制的破坏。监控机制破坏可发生在损伤感应、生长停滞、DNA修复和凋亡机制的任何一个环节上，结果将导致细胞基因组不稳定，突变基因数量增加，这些突变的基因往往就是癌基因和抑癌基因。同时，很大一部分的原癌基因和抑癌基因又是细胞周期调控机制的组成部分。因此，在肿瘤发展过程中，监控机制的异常会使细胞周期调控机制进一步恶化，并导致细胞周期驱动机制的破坏，细胞周期的驱动能力异常强化，细胞进入失控性生长状态，从而细胞出现癌变性生长。
2、原癌基因和抑癌基因还是调控细胞凋亡的重要基因 细胞除了生长、增殖和分化等之外，还存在细胞死亡现象，如程序性细胞死亡或凋亡。有些抑癌基因的过量表达可诱导细胞发生凋亡，而与细胞生存相关的原癌基因的激活则可抑制凋亡，细胞凋亡异常与肿瘤的发生发展密切相关。现已明确，细胞凋亡在肿瘤发生、胚胎发育、免疫反应、肿瘤免疫逃逸、神经系统发育、组织细胞代谢等过程中起重要作用。
值得注意的是，近年来的研究也发现，一些非编码RNA, 如miRNA,在肿瘤发生过程中也具有重要作用。总之，肿瘤分子生物学的进展已经深刻地改变了人们对肿瘤发生和生命现象的认识，并使肿瘤研究从以揭示肿瘤病因和寻找肿瘤治疗方法为目的的单项研究，转变为以研究整个生命现象和全面揭示生命分子机制为目的的综合性系统研究。肿瘤分子生物学必将在整个生命医学研究中发挥越来越重要的作用。