生物化学与分子生物学/RNA实验技术/Trizol法提取总RNA

原理 编辑

Trizol试剂是直接从细胞或组织中提取总RNA的试剂。在样品裂解或匀浆过程中,Trizol能保持RNA的完整性。加入氯仿后离心,样品分成水样层和有机层。RNA存在于水样层中。收集上面的水样层后,RNA可以通过异丙醇沉淀来还原。在除去水样层后,样品中的DNA和蛋白也能相继以沉淀的形式还原。乙醇沉淀能析出中间层的DNA,在有机层中加入异丙醇能析出有机层的蛋白。共纯化DNA对于样品间标准化RNA的产量十分有用。

Trizol试剂可用于小量样品(50~100mg组织,5×106细胞),也可用于大量样品(≥1g组织或≥107细胞),对人、动物、植物和细菌、血液提取都适用,可同时处理大量不同样品。一个小时内即可完成反应,提取的总RNA没有DNA和蛋白质污染,可用于Northern blot、RT-PCR、Dot blot、RNase保护分析等。

本试剂为红颜色,便于区分水相和有机相,同时最大限度的保持RNA的完整性。

保存条件 编辑

2~8℃避光保存12个月。

实验前需要准备的试剂 编辑

Trizol,氯仿,异丙醇,75%乙醇(用RNase-Free水配制),RNase-Free水。

实验前需要准备的物品 编辑

1ml注射器,1.5ml EP管(DEPC处理过),大、中、小号枪头(DEPC处理)

样品前处理注意点 编辑

  1. 选择新鲜血液,不得超过4小时。
  2. 选择新鲜组织,生长旺盛的组织。
  3. 选择新鲜的幼嫩组织。
  4. 选择处于生长旺盛的时期收集细胞。

RNA纯化要求 编辑

  1. 纯化后不应存在对酶(如逆转录酶)有抑制作用的物质。
  2. 排除有机溶剂和金属离子的污染。
  3. 蛋白质、多糖和脂类分子等的污染降到最低程度。
  4. 排除DNA分子的污染。

RNA提取的注意事项 编辑

  1. 杜绝外源酶的污染。
    1. 严格戴好口罩,手套。
    2. 实验所涉及的离心管,Tip头,移液器杆,电泳槽,实验台面等要彻底处理。
    3. 实验所涉及的试剂/溶液,尤其是水,必须确保RNase-Free。
  2. 阻止内源酶的活性。
    1. 选择合适的匀浆方法。
    2. 选择合适的裂解液。
    3. 控制好样品的起始量。
  3. 明确自己的提取目的。
    1. 任何裂解液系统在接近样品最大起始量时,提取成功率急剧下降。
    2. RNA提取成功的唯一经济的标准是后续实验的一次成功,而不是得率。

Rnase污染的10大来源 编辑

  1. 手指头
  2. 枪头
  3. 水/缓冲液
  4. 实验台面
  5. 内源Rnase
  6. RNA样品
  7. 质粒提取
  8. RNA保存
  9. 阳离子(Ca,Mg)
  10. 后续实验所用的酶

流程 编辑

  1. 样品处理:
    • 培养细胞:收获细胞1~5×107,加入1ml Trizol(异硫氰酸胍/酚)(在冰箱旁边取出白细胞即刻加入Trizol),混匀;用1ml注射器反复抽取(约30次)以破裂细胞及剪切DNA,室温静置5min(使核酸蛋白复合物完全分离)。
    • 组织:取50~100mg组织(新鲜或-70℃及液氮中保存的组织均可)置1.5ml EP管中,加入1ml Trizol充分匀浆,室温静置5min。
  2. 可选步骤:如样品中含有较多蛋白质,脂肪,多糖或胞外物质(肌肉,植物结节部分等)可于2-8℃10000×g离心10分钟,取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜,多糖,高分子量DNA,上清中含有RNA。处理脂肪组织时,上层有大量油脂应去除。取澄清的匀浆液进行下一步操作。
  3. 加入0.2ml氯仿,剧烈振荡15~30s,静置2~3min。
  4. 4℃离心,12000g×15min。样品分为三层:底层为黄色有机相,上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中,水相体积约为所用TRIzol试剂的60℅。
  5. 小心吸取上清至一新的DEPC处理过的1.5ml EP管中(如要分离DNA和蛋白质可保留有机相),加入0.5ml异丙醇,将管中液体轻轻混匀,室温静置10min。
  6. 4℃离心,12000g×10min。离心前看不出RNA沉淀,离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。
  7. 弃上清,于沉淀中加入75%乙醇(冰冷)1ml,振摇,充分洗涤沉淀。
  8. 4℃离心,12000g×5min。
  9. 弃上清,短暂离心,小心吸取弃去上清。
  10. 加入适量(20μl)DEPC (Rnase Free)H20溶解RNA(65℃促溶10~15min)。
  11. 取2μl进行电泳,其余-80℃保存。