生物化学与分子生物学/RNA实验技术/MRNA的分离纯化

实验原理

真核生物的mRNA分子是单顺反子，是编码蛋白质的基因转录产物。真核生物的所有蛋白质归根到底都是mRNA的翻译产物，因此，高质量mRNA的分离纯化是克隆基因、提高cDNA文库构建效率的决定性因素。哺乳动物平均每个细胞含有约1x10-5g RNA，理论上认为每克细胞可分离出5～10mg RNA。其中rRNA为75％～ 85％，tRNA占10％～16％，而mRNA仅占1%～5％，并且mRNA分子种类繁多，分子量大小不均一，表达丰度也不一样。

真核生物mRNA有特征性的结构，即具有5’端帽子结构（m7G）和3’端的poly(A)尾巴——绝大多数哺乳动物细胞的3’端存在20~300个腺苷酸组成的poly（A）尾，通常用poly（A+）表示，这种结构为真核mRNA分子的提取、纯化，提供了极为方便的选择性标志，寡聚（dT）纤维素或寡聚（U）琼脂糖亲合层析分离纯化mRNA的理论基础就在于此。

一般mRNA分离纯化的原理就是根据mRNA 3’ 末端含有多poly(A)尾巴结构特性设计的。当总RNA流经寡聚（dT）（即oligo(dT)）纤维素柱时，在高盐缓冲液作用下，mRNA被特异地吸附在oligo(dT)纤维素柱上，在低盐浓度或蒸馏水中，mRNA可被洗下，经过两次oligo(dT)纤维素柱，即可得到较纯的mRNA。

目前常用的mRNA的纯化方法有：

1. 寡聚（dT）－纤维素柱层析法，即分离mRNA的标准方法；
2. 寡聚（dT）－纤维素液相离心法，即用寡聚（dT）－纤维素直接加入到总的  RNA溶液中并使mRNA与寡聚（dT）－纤维素结合，离心收集寡聚（dT）－纤维素／mRNA复合物，再用洗脱液分离mRNA，然后离心除去寡聚（dT）－纤维素；
3. 其它一些方法：如寡聚（dT）－磁性球珠法等。

本实验应用方法（1）进行mRNA的分离纯化作为示例。

试剂与器材

试剂

1. 0.1mol/L NaOH ，每组200mL
2. 寡聚Oligo（dT）-纤维素
3. 加样/洗涤缓冲液1：0.5 mol/L NaCl, 20 m mol/L Tris-HCl(pH 7.6)，每组250mL或0.5mol/L NaCl, 20mmol/L Tris-HCl(pH7.6), 1mmol/L EDTA(pH8.0), 0.1% SDS。
4. 洗涤缓冲液2：0.1 mol/L NaCl, 20 m mol/L Tris-HCl(pH 7.6)，每组250mL或10mmol/L Tris-HCl (pH7.6), 1mmol/L EDTA (pH8.0), 0.05% SDS。配制时可先配制Tris-HCl(pH 7.6)、NaCl、EDTA（pH 8.0）的母液，经高压消毒后按各成分确切含量，经混合后再高压消毒，冷却至65℃时，加入经65℃温育（30min）的10%SDS至终浓度。
5. 5 mol/L NaCl，每组10mL
6. 3 mol/L NaAc pH5.2，每组10mL
7. 无RNase双蒸水(DEPC水)，每组100mL
8. 70%乙醇，每组10mL

注意：溶液5，6的配制都应该加0.1% DEPC处理过夜，溶液1，3，4，8则用经0.1% DEPC处理过的无RNase双蒸水配制，Tris应选用无RNase的级别。溶液配制后，最好能够按一次实验所需的分量分装成多瓶（如10ml或50ml/瓶）保存，每次实验只用一份，避免多次操作造成对溶液的污染。

器材

1. 恒温水浴箱
2. 冷冻高速离心机
3. 紫外分光光度计
4. 巴斯德吸管
5. 玻璃棉
6. 5ml一次性注射器

操作方法

oligo(dT)纤维素的预处理

1. 用0.1mol/L NaOH悬浮0.5-1.0g oligo(dT)纤维素。
2. 将悬浮液装入填有经DEPC水处理并经高压灭菌的玻璃棉的巴斯德吸管中，柱床体积为0.5-1.0mL，用3倍柱床体积的无RNase的灭菌双蒸水冲洗oligo(dT)纤维素。
3. 用3-5倍柱床洗涤缓冲液I冲洗oligo(dT)纤维素，直到流出液的pH值小于8.0。
4. 将处理好的oligo(dT)纤维素从巴斯德吸管倒出，用适当的柱床洗涤缓冲液I悬浮，浓度约为0.1g/mL，保存在4℃待用。

总RNA浓度的调整

1. 把实验一所提的总RNA转到适合的离心管中，如果总RNA的浓度大于0.55mg/mL，则用无RNase的双蒸水稀释至0.55mg/mL，总RNA的浓度对除去rRNA是很重要的。把RNA溶液置于65℃水浴加热5 分钟，然后迅速插在冰上冷却。
2. 加入1/10体积5 mol/L NaCl使RNA溶液中盐的浓度调至0.5 mol/L。

mRNA的分离

mRNA与Oligo(dT)-纤维素结合

用移液器重新悬浮oligo(dT)-纤维素，按下表取适量的oligo(dT)-纤维素到RNA样品中，盖上盖子，颠倒数次将oligo(dT)-纤维素与RNA混匀。于37℃水浴保温并温和摇荡15分钟。

总RNA (mg)	寡聚Oligo(dT)-纤维素(mL)	洗涤缓冲液1，2 (mL)	洗脱体积(mL)
<0.2	0.2	1.0	1.0
0.2-0.5	0.5	1.5	1.5
0.5-1.0	1.0	3.0	3.0
1.0-2.0	2.0	5.0	5.0

转移

取1个5ml的一次性注射器，取适量经过高温灭菌的玻璃棉塞紧前端，并把它固定在无RNase的支架上，再把oligo(dT)-纤维素/RNA悬浮液转移到注射器，推进塞子直至底部，把含有未结合上的RNA液体排到无RNase的离心管中（保留至确定获得足够的mRNA）。

洗涤

根据上表直接用注射器慢慢吸取适量的洗涤缓冲液1，温和振荡，充分重新悬浮mRNA-oligo(dT)-纤维素，推进塞子，用无RNase的离心管收集洗出液。测定每一管的OD260，当洗出液中OD为0时准备洗脱。

洗脱

根据上表直接用注射器慢慢吸取适量（2-3倍柱床体积）的洗脱缓冲液2或无RNase双蒸水到注射器内充分重悬mRNA-oligo(dT)-纤维素，推进塞子以1/3至1/2柱床体积分管收集洗脱液。

测定

测定每一管的OD260，合并含有RNA的洗脱液组分于4℃，2500g，离心2-3分钟，上清转移至新的离心管中，去掉残余的oligo(dT)-纤维素。

沉淀

洗脱液中加入1/10体积的3mol/L NaAc （pH5.2）, 再加入2.5倍体积的冰冷乙醇，混匀后，-20℃30分钟或放置过夜。

离心收集

12000g, 4℃离心15分钟，小心弃去上清，mRNA沉淀此时往往看不见，用70%乙醇漂洗沉淀，12000g, 4℃离心5 分钟，小心弃去上清液，沉淀空气干燥10分钟，或真空干燥10分钟。将mRNA沉淀溶于适当体积的无RNase的双蒸水，立即用于cDNA合成（或保存在70%乙醇中并贮存于-70℃）。

定量

测定OD260和OD280，计算产率以及OD260/OD280的比率（同上一实验）。

注意事项与提示

1. 整个操作过程必须严格遵守无RNase操作环境规则。
2. 提取的总RNA必须完整，不能被降解，这是mRNA质量的先决条件。
3. 总RNA与Oligo(dT)-纤维素的比例要适当，过量的总RNA，容易造成mRNA不纯。
4. RNA溶液与Oligo(dT)-纤维素结合前必须置于65℃加热5 分钟，这一步很重要，其作用
   • （1）破坏mRNA的二级结构，特别是poly(A+)尾处的二级结构，使poly(A+)尾充分暴露，提高poly(A+)RNA回收率；
   • （2）解离mRNA与rRNA的结合。加热后应立即插入冰上，以免由于温度的缓慢下降使mRNA又恢复其二级结构。

     

     mRNA变性琼脂糖凝胶电泳示意图（Lane 1, 0.24–7.5kb RNA分子量Maker; Lane 2, 老鼠肝脏总 RNA; Lane 3, 老鼠肝脏mRNA）

5. 应注意mRNA不能被DNA污染，即使是1 ppm DNA污染，也可严重影响实验结果。
6. mRNA制备后，可用变性琼脂糖凝胶电泳捡测其完整性和有无DNA污染。提取的mRNA应该在0.5~8.0kb之间呈现弥散状，无明显区带，但大部分的mRNA应在1-2.0kb范围内（如图）。一般来说，经过一次纯化分离的mRNA还会有微量的rRNA残留，但一般来说不会对后续实验造成很大的影响，如果样品充足，可将经过一次纯化分离的mRNA再纯化一次，进一步提高其纯度。
7. 为防止mRNA降解，应避免多次冻融，可将mRNA少量分装后保存。另外，如果有低温冰箱,最好在 -70℃～ -80℃保存。 也可将mRNA在70%乙醇中-70℃保存一年以上。
8. 寡聚(dT)纤维素柱用后可用0.3mol/l NaOH洗净，然后用层析柱加样缓冲液平衡，并加入0.02%叠氮钠（NaN3)冰箱保存，重复使用。每次用前需用NaOH、灭菌 ddH2O、层析柱加样缓冲液依次淋洗柱床。
9. 一般而言，107哺乳动物培养细胞能提取1-5μg Poly(A+)RNA，约相当于上柱总RNA量的1%-2%。

实验安排

1． 第一天：试剂的配制和所用一次性塑料制品和玻璃器皿的去RNase处理（0.1%DEPC浸泡或高温干烤）。

2． 第二天：进行（一）、（二）和（三）1-6。

3． 第三天：进行（三）7和变性琼脂糖凝胶电泳捡测mRNA。

4． 为了避免由于保存时间过长造成的RNA降解，最好能将总RNA提取、mRNA的分离纯化、RT-PCR和cDNA文库构建实验安排在连续的时间内进行。

引物的设计一般遵循的原则

1. 典型的引物20-24个核苷长。引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。但是太长的引物可能会与错误配对序列杂交降低了特异性，同时因为 比短序列杂交慢，从而降低了产量。
2. 设计5'端和中间区为G或C，且GC含量为50％~60％的引物，以增加引物的稳定性及其与目的序列杂交的稳定性。
3. 3'末端尽量不要富含GC。设计引物时保证在最后5个核苷中含有3个A或T。但因为3'端核苷需要同模板退火以供聚合酶催化延伸，为了避免3'末端的错误配对，所以末端尽量避免为核苷A。
4. 在引物对3'末端尽量避免互补序列以免形成引物二聚体，抑制扩增。如果引物序列可能产生内部二级结构会破坏引物退火稳定性，也要尽量避免。
5. 此外，目的序列上并不存在的附加序列，如限制位点和启动子序列，可以加入到引物5'端而不影响特异性。

有时候，仅有有限的序列信息可供用于引物设计。比如，如果仅知道氨基酸序列，可以设计简并引物，同时使用较高的引物浓度（1μM到3μM），因为许多简并混合物中的引物不是特异性针对目的模板。

为了增加特异性，可以参考密码子使用表，根据不同生物的碱基使用偏好，减少简并性。次黄嘌呤可以同所有的碱基配对，降低引物的退火温度。不要在引物的3'端使用简并碱基，因为3'端最后3个碱基的退火足以在错误位点起始PCR。