生物化学与分子生物学/DNA实验技术/变性梯度凝胶电泳

实验原理

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变性梯度凝胶电泳(DGGE)是一种根据DNA片段的熔解性质而使之分离的凝胶系统。核酸的双螺旋结构在一定条件下可以解链,称之为变性。核酸50%发生变性时的温度称为熔解温度(Tm)。Tm值主要取决于DNA分子中GC含量的多少。DGGE将凝胶设置在双重变性条件下:温度50~60 ℃,变性剂0~100%。当一双链DNA片段通过一变性剂浓度呈梯度增加的凝胶时,此片段迁移至某一点变性剂浓度恰好相当于此段DNA的低熔点区的Tm值,此区便开始熔解,而高熔点区仍为双链。这种局部解链的DNA分子迁移率发生改变,达到分离的效果。Tm的改变依赖于DNA序列,即使一个碱基的替代就可引起Tm值的升高和降低。因此,DGGE可以检测DNA分子中的任何一种单碱基的替代、移码突变以及少于10个碱基的缺失突变。

为了提高DGGE的突变检出率,可以人为地加入一个高熔点区——GC夹。GC夹(GC clamp)就是在一侧引物的5′端加上一个30~40bp的GC结构,这样在PCR产物的一侧可产生一个高熔点区,使相应的感兴趣的序列处于低熔点区而便于分析。因此,DGGE的突变检出率可提高到接近于100%。

作为一种突变检测技术,DGGE具有如下的优点:

  1. 突变检出率高。DGGE的突变检出率为99%以上。
  2. 检测片段长度可达1kb,尤其适用于100~500bp的片段。
  3. 非同位素性。DGGE不需同位素掺入,可避免同位素污染及对人体造成的伤害。
  4. 操作简便、快速。DGGE一般在24小时内即可获得结果。
  5. 重复性好。但是,该方法需要特殊的仪器,而且合成带GC夹的引物也比较昂贵。

实验方法

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  • 变性梯度凝胶电泳(DGGE)

实验材料

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  • DNA样品

试剂、试剂盒

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  • 尿素
  • 去离子甲酰胺
  • 丙烯酰胺
  • 甲叉双丙烯酰胺
  • 琼脂糖

仪器、耗材

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  • PCR扩增仪
  • 变性梯度凝胶电泳仪
  • 凝胶成像及分析系统
  • 紫外透射仪
  • 高速离心机
  • 电泳仪
  • 电泳槽
  • 微量加样器(200μl,20μl);Tip头(200μl,20μl)
  • Tip头
  • Tip头盒(200μl,20μl)
  • Eppendorf管(0.5ml,0.2ml)
  • Eppendorf管架
  • PCR扩增相关试剂

实验步骤

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  1. PCR反应(同前):其中,上游引物加40bp [GC] Clamp。
  2. PCR产物经琼脂糖凝胶电泳确认。
  3. 垂直变性梯度凝胶电泳:变性梯度递增的方向与电泳方向垂直。所使用的胶为6%聚丙烯酰胺凝胶,变性浓度为0~100%。其中,含7 M尿素和40%去离子甲酰胺的胶为100%变性,不含尿素和去离子甲酰胺的胶为0%变性。垂直变性梯度凝胶电泳主要是检测引物的最适解链条件(即变性浓度)。PCR产物加上样缓冲液后上样,300~400μl/孔,电压150V,温度60℃,时间2~4小时。
  4. 平行变性梯度凝胶电泳:变性梯度递增的方向与电泳方向平行。根据垂直变性梯度凝胶电泳检测的解链区域的变性浓度,制备相应变性浓度的平行变性梯度凝胶,检测各标本是否存在突变。PCR产物加上样缓冲液后,25μl~30μl/孔,电压150V,温度60℃,时间3~6小时。
  5. 染色5分钟,凝胶成像仪分析结果。

注意事项

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  1. 该实验中提取DNA,以及DGGE操作中接触到得很多药品都有毒,还有致癌、变性等毒害,一定要严格操作,做好防护保护自己。
  2. 严格按操作步骤。