生物化学与分子生物学/线粒体氧化体系与呼吸链

生物氧化 - 线粒体氧化体系与呼吸链 - 氧化磷酸化与ATP的生成 - 氧化磷酸化的影响因素 - 其他氧化与抗氧化体系
线粒体氧化体系的主要功能是为机体提供能量，包括热能、ATP等。在线粒体内，糖、脂肪、蛋白质等营养物质在被彻底氧化分解为CO₂和H₂O的过程中释放能量，但其氧化过程需要在酶的催化下逐步进行，能量也不会在瞬间大量释放产生高温、高热，而是逐渐释放并储存在ATP中。营养物质被氧化时常发生脱氢反应，脱下来的氢(H⁺+e^-）以NADH+H⁺(简写为NADH)、FADH₂等形式存在。 NADH和FADH₂在线粒体被氧化时，需要一系列的酶催化，逐步脱氢、失电子，最终将电子和H⁺传递给氧而生成水，同时释放能量用于生成ATP。因此，线粒体需要多种具有传递氢和电子的组分参与氧化还原反应。

线粒体氧化体系含多种传递氢和电子的组分

底物脱氢和失去电子是生物氧化的基本化学过程。能够传递氢和电子的物质，如金属离子、小分子有机化合物、某些蛋白质等称之为递电子体或递氢体。线粒体氧化体系主要将NADH和FADH₂中的H⁺和电子传递给氧，参与其过程的递氢体和递电子体如下。

烟酰胺腺嘌呤核苷酸传递氢和电子

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide, NAD⁺), 通过烟酰胺环传递H⁺和电子。烟酰胺环的五价氮原子，能接受2H中的双电子成为三价氮，为双电子传递体，同时芳环接受一个H⁺进行加氢反应。由于此反应只能接受l个H⁺和2个电子，游离出一个H⁺在介质中，因此将还原型的NAD⁺写成NADH+H⁺(简写为NADH)。NAD⁺是许多脱氢酶的辅酶，有传递氢和电子的功能。此外，NAD⁺结构中核糖的2位羟基被磷酸化后生成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸 (nicotinamide adenine dinucleotide phosphate, NADP⁺)。NADP⁺通过相同的机制接受氢后生成NADPH+H⁺，发挥传递氢和电子的作用，但参与不同的反应。

黄素核苷酸衍生物传递氢和电子

黄素单核苷酸(flavin mononucleotide, FMN)和黄素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenine dinucleotide, FAD)是维生素B₂与核苷酸形成的有机化合物，两者均通过维生素B₂中的异咯嗪环进行可逆的加氢和脱氢反应。异咯嗪环可接受l个H⁺和l个电子形成不稳定的FMNH^·和FADH^·,再接受l个H⁺和一个电子转变为还原型FMNH₂和FADH₂。因此FMN、FAD发挥传递氢和电子的作用, 是黄素蛋白(flavoprotein)的辅基。

有机化合物泛醌传递氢和电子

泛醌(ubiquinone)又称辅酶Q(coenzyme Q, CoQ或Q)，是一种脂溶性醌类化合物，其结构中异戊二烯单位的数目因物种而异，人体内的Q是10个异戊二烯单位连接的侧链，用Q₁₀表示。Q的疏水特性使其能在线粒体内膜中自由扩散。Q结构中的苯醌部分接受l个电子和1个H⁺还原为半醌(QH^·），再接受1个电子和1个H⁺还原为二氢泛醌(QH₂)。反之，QH₂可逐步失去H ⁺和电子被氧化为Q。因此Q可进行双、单电子的传递。

铁硫蛋白和细胞色素蛋白传递电子

铁硫蛋白(iron-sulfur protein), 因其含有铁硫中心(iron-sulfur center, Fe-S center)而得名。Fe-S是Fe离子通过与无机硫(S)原子及铁硫蛋白中半胱氨酸残基的SH连接而成。Fe-S有多种形式，可以是单个Fe离子与4个半胱氨酸残基的SH相连，也可以是2个、4个Fe离子通过与无机S原子及半胱氨酸残基的SH连接，形成Fe₂S₂、Fe₄S₄。Fe-S通过Fe²⁺↔Fe³⁺+e^-的可逆反应，每次传递一个电子，因此铁硫蛋白是单电子传递体。
细胞色素(cytochrome, Cyt)是一类含血红素样辅基的蛋白质。各种还原型Cyt均有3个特征性的α、β、γ可见光吸收峰，根据其吸光度和最大吸收波长不同，分为Cyt a、Cyt b和Cyt c三类及不同的亚类, 其所含的血红素辅基分别称为血红素a、b和c。Cyt光吸收的差异是由于血红素中卟啉环的侧链基团、血红素在蛋白质中所处环境不同所致。血红素a的卟啉环侧链中，1个甲基被甲酰基取代，1个乙烯基连接聚异戊二烯长链；血红素b的结构与血红蛋白中的血红素相同。 血红素a和b都通过非共价键与Cyt a和Cyt b蛋白相连。而Cyt c蛋白，其血红素卟啉环的乙烯基侧链通过共价键与蛋白质中半胱氨酸残基的—SH相连。细胞色素蛋白通过辅基血红素中的Fe离子发挥单电子传递体的作用。

具有传递电子能力的蛋白质复合体组成呼吸链

线粒体是真核细胞生成ATP的主要部位。NADH、FADH₂在线粒体中通过逐步、连续的酶促反应被氧化，并逐步释放能量，除了产生热能外，释放的能量主要被ADP捕获用于生成ATP。催化此连续反应的酶是由多个含辅因子的蛋白质复合体组成，按一定顺序排列在线粒体内膜中，形成一个连续传递电子／氢的反应链，氧分子最终接受电子和H⁺生成水，故称为电子传递链(electron transfer chain)。由于此体系需要消耗氧，与需氧细胞的呼吸过程有关，也称之为呼吸链(respiratory chain)。
呼吸链主要由位于线粒体内膜上的4种蛋白质复合体(complex)组成，分别称之为复合体Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ。每个复合体都由多种酶蛋白、金属离子、辅酶或辅基组成。复合体的辅因子通过得失电子的方式传递电子；有些复合体是跨膜蛋白质，可将H⁺从线粒体基质侧转运至细胞质侧，形成线粒体内膜两侧H⁺浓度和电荷的梯度差。因此，呼吸链在传递电子的过程中，伴随着H⁺的跨膜转运，下面将分别叙述各复合体的组成、辅因子、结构特点以及功能。

复合体Ⅰ将 NADH 中的电子传递给泛醌

复合体Ⅰ又称 NADH-Q 还原酶或 NADH 脱氢酶，是呼吸链的主要入口，其功能是接受来自 NADH 的电子并转移给Q。 复合体Ⅰ是由黄素蛋白、铁硫蛋白等组成的跨膜蛋白质，呈“L”型，其长臂的一端突出于线粒体基质中，包括黄素蛋白（含 FMN 和 Fe-S 辅基）、铁硫蛋白（含 Fe-S 辅基），可结合基质中的NADH；嵌于内膜的横臂为复合体的疏水部分，含 Fe-S 辅基。黄素蛋白和铁硫蛋白均通过辅基发挥传递电子作用。
复合体Ⅰ传递电子的过程：黄素蛋白辅基 FMN 从基质中接受NADH 中的2H⁺和2e^-生成 FMNH₂ ,经过一系列的 Fe-S 将电子传递给内膜中的 Q, 形成 QH₂, 即：NADH→FMN→Fe-S→Q。由于Q在线粒体内膜中可自由移动，在各复合体间募集并穿梭传递氢，因此在电子传递和质子的移动中发挥核心作用。
复合体Ⅰ还具有质子泵功能：将一对电子从 NADH 传递给 Q 的过程中，能将 4 个H⁺从线粒体的基质侧(negative side, N 侧）泵到膜间隙侧(pos山ve side, P 侧），泵出质子所需的能量来自电子传递过程。

复合体Ⅱ将电子从琥珀酸传递到泛醌

复合体Ⅱ是琥珀酸－泛醌还原酶，即三羧酸循环中的琥珀酸脱氢酶，其功能是将电子从琥珀酸传递给Q。人复合体Ⅱ通过其疏水亚基锚定于线粒体内膜，而伸向基质的亚基含有结合底物琥珀酸的位点，以及 Fe-S 和 FAD 辅基。
复合体Ⅱ传递电子的过程：催化底物琥珀酸的脱氢反应，使 FAD 转变为 FADH₂ ,后者再将电子经Fe-S 传递到 Q。即：琥珀酸→FAD→Fe-S→Q。此过程释放的自由能较小，不足以将H⁺泵出线粒体内膜，因此复合体Ⅱ没有H⁺泵的功能。代谢途径中另外一些含 FAD 的脱氢酶，如脂酰 CoA 脱氢酶、α-磷酸甘油脱氢酶、胆碱脱氢酶等，通过不同的方式将相应底物脱下的氢经 FAD 传递给 Q,进入呼吸链。

复合体Ⅲ将电子从还原型泛醌传递至细胞色素c

复合体Ⅲ又称泛醌－细胞色素c还原酶，其功能是接受QH₂的电子并传递给 Cyt C。Q从复合体Ⅰ、复合体Ⅱ募集氢，产生的QH₂穿梭至复合体Ⅲ，后者将电子传递给Cyt c蛋白。
人复合体Ⅲ由Cyt b(b₅₆₂ ，b₅₆₆)、Cyt c₁和铁硫蛋白组成二聚体，呈梨形。其中Cyt c₁和铁硫蛋白的疏水区段将复合体锚定在线粒体内膜。复合体Ⅲ有2个Q 结合位点，分别处于膜间隙侧（Q_p）和基质侧（Q_N）位点。
复合体Ⅲ传递电子的过程：由于Q 是双电子传递体，而Cyt c是单电子载体，所以复合体Ⅲ将电子从QH₂传递给Cyt c的过程是通过“Q循环”(Q cycle)实现的。简单而言，QH₂结合在Q_P位点，分别将2e^-经Fe-S 传递给Cyt c₁和结合在Q_N位点的Q。此过程重复一次后，Q_P位点的QH₂将2e^-经Cyt c₁传递给2分子Cyt c, 重新释放Q 到内膜中，而Q_N位点的Q接受2e^-和基质的2H⁺被还原为QH₂。因此每2分子QH₂经过Q循环，生成1分子Q 和1分子QH₂, 将2e^-经Cyt c₁传递给2分子Cyt c。即：QH₂→Cyt b→Fe-S→Cyt c₁→Cyt c。另外， 复合体Ⅲ还具有质子泵的功能，每传递2e^-向膜间隙释放4H⁺。
Cyt c是呼吸链中唯一的水溶性球状蛋白质，与线粒体内膜的外表面疏松结合，不包含在上述复合体中。Cyt c从复合体Ⅲ中的Cyt c₁获得电子传递到复合体Ⅳ。

复合体Ⅳ将电子从细胞色素c传递给氧

复合体Ⅳ又称细胞色素c氧化酶(cytochrome c oxidase), 是电子传递链的出口，其功能是接受还原型Cyt c的电子并传递给O₂生成H₂O。复合体Ⅳ也有质子泵功能，每传递2e^-将2个H⁺泵至膜间隙侧。
人复合体Ⅳ包含13个亚基，亚基1～3构成复合体Ⅳ的核心结构，含Fe、Cu离子结合位点，发挥电子传递作用。亚基2的半胱氨酸-SH可结合2个Cu离子，每个Cu离子都可传递电子，形成一个双核中心(binuclear center)的功能单元，称Cu_A中心，其结构类似Fe₂S₂。Cu_A中心与Cyt a蛋白中血红素的Fe极为接近(1.5nm), 电子可由Cu_A中心传递到Cyt a。而亚基l含血红素a和a₃，在血红素a₃邻近处结合1个Cu离子，称Cu_B, 因此血红素a₃中的Fe离子和Cu_B形成第二个双核中心，即血红素a₃-Cu₈(Fe-Cu)中心。双核中心是复合体Ⅳ发挥电子传递的功能单元。
复合体Ⅳ传递电子的过程：还原型Cyt c蛋白提供的电子经Cu_A中心传递到Cyt a, 再到Fe-Cu中心。需要依次传递4个电子，并从线粒体基质获得4个H⁺，最终将1分子O₂还原为2分子H₂O。其过程为：Cyt a传递第一个、第二个电子到氧化态的Cyt a₃-Cu_B双核中心(Cu²⁺和Fe³⁺), 使Cu²⁺和Fe³⁺被还原为Cu⁺和Fe²⁺,并结合O₂分子，形成过氧桥连接的Cu_B和Cyt a₃, 相当于2e^-传递至结合的O₂。 中心再获得2个H⁺和第三个电子，O₂分子键断开，Cyt a₃出现Fe⁴⁺中间态。再接受第四个电子，Fe⁴⁺还原为Fe³⁺并形成Cu_B²⁺和Fe³⁺各结合1个OH基团的中间态。 最后再获得2个H⁺，双核中心解离出2个H₂O分子后恢复初始的氧化态。即：Cyt c→CuA→Cyt a一Cyt a₃-CuB→O₂。生成的H₂O通过亚基l和3之间的亲水通道排入胞质侧。
上述O₂在获得电子过程产生的具有强氧化性的O_2·^-和O₂^2-离子中间物始终和双核中心紧密结合，通常不会对细胞组分造成损伤。

NADH和FADH₂是呼吸链的电子供体

营养物质的分解代谢中，大部分脱氢酶以NAD⁺，NADP⁺，FMN或者FAD为辅酶或辅基，用来接受从底物上脱下来的成对氢，生成还原态的NADH+H⁺ ,NADPH+H⁺ ,FMNH₂和FADH₂, 它们都是水溶性的电子载体。由于呼吸链的复合体Ⅰ即为NADH脱氢酶，可使线粒体中的NADH通过呼吸链彻底氧化参与能量代谢。虽然NADPH通过相同的机制传递氢，但所含的磷酸基团可被生物合成过程中的酶特异性识别，主要用于还原反应，而非参与能量代谢。复合体Ⅱ是三羧酸循环中的琥珀酸脱氢酶，通过结合底物琥珀酸并将其脱氢氧化，产生的FADH₂直接进入呼吸链进行氧化释能。因此NADH和FADH₂是呼吸链的电子供体，而FMN 和FAD 作为黄素蛋白的辅基参与电子传递。
呼吸链由NADH 和FADH₂提供氢，通过4个蛋白质复合体、Q, 以及介于复合体Ⅲ与Ⅳ之间的Cyt c 共同完成电子的传递。复合体Ⅱ并不是处于复合体Ⅰ的下游，复合体Ⅰ和复合体Ⅱ分别获取各自的氢，向Q传递。因此4个复合体与Q和Cyt c 组成了两条电子传递链。一条称为NADH呼吸链，以NADH为电子供体，从NADH开始到还原O₂ 生成H₂O。电子传递顺序是：
NADH→复合体Ⅰ→Q→复合体Ⅲ→Cyt c→复合体Ⅳ→O₂
另一条称为FADH₂呼吸链，也称琥珀酸氧化呼吸链，以FADH₂ 为电子供体，经复合体Ⅱ到O₂ 而生 成H₂O。电子传递顺序是：
琥珀酸→复合体Ⅱ→Q→复合体Ⅲ→Cyt c→复合体Ⅳ→O₂
呼吸链各组分的排列顺序是由下列实验确定的：

• 根据呼吸链各组分的标准氧化还原电位进行排序。标准氧化还原电位E°(单位：电压Volts)是指在特定条件下，参与氧化还原反应的组分对电子的亲和力大小。电位高的组分对电子的亲和力强，易接受电子。相反，电位低的组分倾向于给出电子。因此，呼吸链中电子应从电位低的组分向电位高的组分进行传递。
• 底物存在时，利用呼吸链特异的抑制剂阻断某一组分的电子传递，在阻断部位以前的组分处于还原状态，后面的组分处于氧化状态。根据各组分的氧化和还原状态吸收光谱的改变分析其排列次序。
• 利用呼吸链各组分特有的吸收光谱，以离体线粒体无氧时处于还原状态作为对照，缓慢给氧，观察各组分被氧化的顺序。
• 在体外将呼吸链拆开和重组，鉴定四种复合体的组成与排列。