細胞生物學/細胞增殖檢測MTT法

細胞增殖檢測：MTT法

MTT分析法以活細胞代謝物還原劑3-（4，5）-dimethylthiahiazo （-z-y1）-3，5-di- phenytetrazoliumromide， MTT噻唑藍為基礎。MTT為黃色化合物，是一種接受氫離子的染料，可作用於活細胞線粒體中的呼吸鏈，在琥珀酸脫氫酶和細胞色素C的作用下tetrazolium環開裂，生成藍色的formazan結晶，formazan結晶的生成量僅與活細胞數目成正比（死細胞中琥珀酸脫氫酶消失，不能將MTT還原）。還原生成的formazan結晶可在含50%的N，N-二甲基甲醯胺和20%的十二甲基磺酸鈉（pH 4.7）的MTT溶解液中溶解，利用酶標儀測定490 nm處的光密度OD值，以反映出活細胞數目。也可以用DMSO來溶解。

MTT粉末和溶液保存時都需要避光，用鋁箔紙包好就可以。實驗的時候我一般關閉超淨台上的日光燈來避光，覺得這樣比較好。

步驟

接種細胞

用含10%胎小牛血清得培養液配成單個細胞懸液，以每孔1000－10000個細胞接種到96孔板，每孔體積200ul。

培養細胞

同一般培養條件，培養3－5天（可根據試驗目的和要求決定培養時間）。

呈色

培養3－5天後，每孔加MTT溶液（5mg/ml用PBS 配）20ul.繼續孵育4小時，終止培養，小心吸棄孔內培養上清液，對於懸浮細胞需要離心後再吸棄孔內培養上清液。每孔加150ul DMSO，振盪10分鐘，使結晶物充分融解。

比色

選擇490nm波長，在酶聯免疫監測儀上測定各孔光吸收值，記錄結果，以時間為橫坐標，吸光值為縱坐標繪製細胞生長曲線。

注意事項

1、選擇適當得細胞接種濃度。

2、避免血清干擾：一般選小於10%的胎牛血清的培養液進行試驗。在呈色後儘量吸盡孔內殘餘培養液。

3、設空白對照：與試驗平行不加細胞只加培養液的空白對照。其他試驗步驟保持一致，最後比色以空白調零。

MTT實驗吸光度最後要在0-0.7之間，超出這個範圍就不是直線關係，

IC50是半抑制率，意思是抑制率50％的時候藥物的濃度。把藥品稀釋成不同的濃度，然後計算各自的抑制率，以藥品的濃度為橫坐標，抑制率為縱坐標作圖，然後得到50％抑制率時候的藥品濃度，就是IC50。要點：藥品2倍稀釋，多做梯度，做點線圖即可！

舉例

各組濃度0.1、0.01、0.001、0.0001、0.00001、0.000001，稀釋倍數為10，最大濃度為0.1，抑制率為0.95、0.80、0.65、0.43、0.21，0.06。代入計算公式：

Pm=0.95

Pn=0.06

P=0.95+0.80+0.65+0.43+0.21+0.06=3.1

Xm=lg0.1=-1

lgI=lg0.1/0.01=1

lgIC50=-1-1*（3.1-（3-0.95-0.06）/4）=-3.6025

IC50=0.00025

有一個公式可供參考；

lgIC50=Xm-I（P-（3-Pm-Pn）/4）

Xm：lg 最大劑量

I：lg（最大劑量/相臨劑量）

P：陽性反應率之和

Pm：最大陽性反應率

Pn：最小陽性反應率

抑制率=1-加藥組OD值/對照組OD值

公式中的最大最小陽性反應率就是最大最小抑制率

例：

用96孔板培養SMMC-7721肝癌做MTT測細胞活力，應該加多少1640培養基，多少MTT和DMSO合適?根據書上說的加200ul1640，20ulMTT，150ulDMSO 加DMSO之前要儘量去掉培養液，便於DMSO溶解甲臢顆粒進行比色測定

一般每孔4000個細胞為宜，既細胞濃度在20000個/ml，MTT加20ul，作用四小時後洗掉上清液，注意不要將甲瓉洗掉，然後每孔加150ul DMSO，在脫色搖床上振盪10分鐘，然後測吸光值。

一般要低於IC50，避免非調亡性殺傷的細胞太多，造成流式細胞儀檢測碎片太多。我一般用1/2-1/3的IC50，作用時間為36h。一般腫瘤細胞系空白處理的調亡率應低於1%，用藥後一般為5-10%（Annexin V），細胞周期的亞G0峰比較明顯。

MTT法心得

MTT實驗是檢測細胞活力的實驗方法，由於細胞活力與細胞數呈正相關，因此也常常用來檢測細胞的增殖情況。

MTT的原理

活細胞有琥珀酸脫氫酶，將MTT還原成棕褐色沉澱。由於一般介紹園子裡已經很多，筆者將自己的心得按照實驗流程與大家交流交流。

MTT法檢測細胞增殖實驗的注意事項

培養好細胞點板

養細胞沒啥好說的，如果不知道細胞如何養，那就看看相關的文獻方法。如果知道了細胞的名字，就可以上www.atcc.org檢索細胞的培養信息，這個網站上的培養方法是標準培養方法。當然可以根據自己實驗要求進行修改。由於細胞計數很繁瑣，點板時的細胞濃度是最難掌握的，這一點筆者的心得如下：

自己先將細胞養一段時間，大概了解細胞的增殖情況，在MTT檢測時實際上要求細胞大概能長滿96-孔板的80-90%，如果打算養48小時就檢測，根據細胞的生長情況反推點板時的細胞濃度狀況。這時可以將細胞不進行計數，將消化好的細胞混勻後（可能是10ml）直接在一個廢棄（最好進行過無菌處理）的96孔板中依次加入180、100、50微升細胞，將細胞放置幾分鐘就會沉到板底了，這時在顯微鏡下觀察，推測哪個孔的細胞48 h能基本長滿板底，假設50微升的孔比較合適，而點板時沒孔需點200 微升，那麼就將細胞濃度再稀釋4倍就可以正式點板了，這時順便將細胞進行計數（因為實驗記錄要求寫啊）。這樣就OK了！如果細胞還太多，將細胞稀釋4倍後再重複以上操作。注意：不要過分信賴細胞計數，因為細胞計數的取樣量為20 微升左右，由於顆粒的分布不均勻，代表性是很差的。建議：細胞計數一定要會，但不要完全依賴它。

點板時一定要將細胞消化成單個細胞，而且一定要混勻，最好用排槍，否則，MTT的SD會狂大！

點板布局

其實這一點很多人不懈一顧。如果你的細胞要養48 h或更長，建議不要吝嗇96-孔板的四周邊孔，這32個邊孔不能使用，建議加入滅菌PBS以飽和中間64個孔的水分。因為細胞培養過程中，邊孔的水分蒸發很快，培養液及裡面的藥物會出現濃縮現象，細胞的狀況就複雜了，有些人稱之為%26ldquo;邊緣效應%26rdquo;這些孔的SD也會狂大，既然如此，不如不用。

加MTT

如果確認你考察的藥物沒有氧化還原性，你可以直接加入MTT溶液（總體積的1/10），如果你沒有把握，建議在加MTT前換一次液；如果你肯定考察的藥物的氧化還原性很強，比如穀胱甘肽、Vit E、VitC，那建議你用PBS將細胞洗洗，否則這些藥物會將MTT還原成棕褐色沉澱，這種效果可能是你不需要的。

加入MTT後的反應

時間為3-4h，此時棄去各孔中的液體在加入200微升的DMSO。為了將沉澱溶解完全，儘可能將水棄除乾淨，加入DMSO後在搖床上震搖10min。提醒：如果你的細胞貼壁不好，此時的沉澱在棄去液體時易丟失，因此貼壁不好的細胞在點板時記得將96孔板用多聚賴氨酸處理處理，要麼在棄液體時先用甩板機離心，再輕輕棄去液體。關於DMSO的量，每孔的體積有點兒差異不干擾檢測，只要能將沉澱完全溶解就行了。至於DMSO的體積差異不同為什麼不影響檢測值已經被數學證明了，在此我不多說，如果有人不明白我再證明給他看。當然為了養成良好的實驗習慣，DMSO的體積還是一致的好。

檢測MTT

還原的MTT在460-630均有較好的吸收，如果你的酶標儀是濾光片，可以選470 nm左右或630 nm左右的濾光片，如果酶標儀有單波長，你可以在檢測前掃描一下吸收譜，選用最大細說波長檢測就是了，最大波長，大概在550nm附近，必要時加一個參比波長以扣除非特異性吸收。

吸收值分析

在理想的MTT實驗中，如果是細胞抑制實驗，不加藥物處理組的吸收值應該在0.8-1.2左右，太小檢測誤差占的比例較多，太大吸收值可能已經超出線性範圍。這個原理在朗伯-比爾定律中有解釋。

建議

如果你覺得MTT中出現的問題不好解決，那麼建議你做CCK-8實驗，原理與MTT相似，但操作上簡化些，當然，費用也稍微高一些。