生物化学与分子生物学/原核基因表达调控

基因表达调控 - 基因表达调控的基本概念与特点 - 原核基因表达调控 - 真核基因表达调控
原核生物基因组是具有超螺旋结构的闭合环状DNA分子,在结构上有以下特点:①基因组中很少有重复序列;②编码蛋白质的结构基因为连续编码,且多为单拷贝基因,但编码rRNA的基因仍然是多拷贝基因;③结构基因在基因组中所占的比例(约占50%)远远大于真核基因组;④许多结构基因在基因组中以操纵子为单位排列。此外,原核生物的细胞结构也比较简单,其基因组的转录和翻译可以在同一空间内完成,并且时间上的差异不大。在转录过程终止之前mRNA就已经结合在核糖体上,开始了蛋白质的生物合成。

操纵子是原核基因转录调控的基本单位

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大肠杆菌的RNA聚合酶由σ亚基(或称σ因子)和核心酶构成,其中σ亚基的作用是识别和结合在DNA模板上的启动序列,启动转录过程。原核生物在转录水平的调控主要取决于转录起始速度,即主要调节的是转录起始复合物形成的速度。
原核生物大多数基因表达调控是通过操纵子机制实现的。操纵子由结构基因、调控序列和调节基因组成。
结构基因通常包括数个功能上有关联的基因,它们串联排列,共同构成编码区。这些结构基因共用一个启动子和一个转录终止信号序列,因此转录合成时仅产生一条mRNA长链,为几种不同的蛋白质编码。这样的 mRNA 分子携带了几条多肽链的编码信息,被称为多顺反子(polycistron) mRNA。
调控序列主要包括启动子和操纵元件(operator) 。启动子是 RNA 聚合酶结合的部位,是决定基 因表达效率的关键元件。各种原核基因启动序列特定区域内,通常在转录起始点上游-10及-35区域存在一些相似序列,称为共有序列。E.coli 及一些细菌启动序列的共有序列在-10区域是TATAAT,又称Pribnow盒,在-35区域为TTGACA。这些共有序列中的任一碱基突变或变异都会影响 RNA 聚合酶与启动子的结合及转录起始。因此,共有序列决定启动子的转录活性大小。操纵元件并非结构基因,而是一段能被特异的阻遏蛋白识别和结合的 DNA 序列。操纵序列与启动序列毗邻或接近,其 DNA 序列常与启动子交错、重叠,它是原核阻遏蛋白(repressor) 的结合位点。 当操纵序列结合有阻遏蛋白时会阻碍 RNA 聚合酶与启动子的结合,或使 RNA 聚合酶不能沿 DNA 向前移动,阻遏转录,介导负性调节。原核操纵子调控序列中还有一种特异的 DNA 序列可结合激活蛋白(activator),结合后RNA聚合酶活性增强,使转录激活,介导正性调节。
调节基因(regulatory gene) 编码能够与操纵元件结合的阻遏蛋白。阻遏蛋白可以识别、结合特异的操纵元件,抑制基因转录,所以阻遏蛋白介导负性调节(negative regulation) 。阻遏蛋白介导的负性调节机制在原核生物中普遍存在。
此外,还有一些调控蛋白质对原核基因转录调控起着重要的作用,如特异因子和激活蛋白。这些调控蛋白质的作用分别是:①特异因子决定 RNA 聚合酶对一个或一套启动序列的特异性识别和结合个或能力。②激活蛋白可结合启动子邻近的 DNA 序列,提高 RNA 聚合酶与启动序列的结合能力,从而增强RNA聚合酶的转录活性,是一种正性调节(positive regulation)。分解(代谢)物基因激活蛋白(catabolite gene activator protein, CAP) 就是一种典型的激活蛋白。有些基因在没有激活蛋白存在时,RNA 聚合酶很少或根本不能结合启动子,所以基因不能转录。
阻遏蛋白、特异因子和激活蛋白等原核调控蛋白都是一些 DNA结合蛋白。凡是能够诱导基因表 达的分子称为诱导剂,而凡是能够阻遏基因表达的分子称为阻遏剂。

乳糖操纵子是典型的诱导型调控

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操纵子在原核基因表达调控中具有普遍意义。大多数原核生物的多个功能相关基因串联在一起,依赖同一调控序列对其转录进行调节,使这些相关基因实现协调表达尽。以大肠杆菌的乳糖操纵子(lac operon)为例介绍原核生物的操纵子调控模式。乳糖代谢酶基因的表达特点是:在环境中没有乳糖时,这些基因处于关闭状态;只有当环境中有乳糖时,这些基因才被诱导开放,合成代谢乳糖所需要的酶。乳糖操纵子是最早发现的原核生物转录调控模式。

乳糖操纵子的结构

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E.coli的乳糖操纵子含Z、Y及A三个结构基因,分别编码β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)、通透酶(permease)和乙酰基转移酶(acetyltransferase), 此外还有个操纵序列O(operator, O)、一个启动子P (promoter, P)及个调节基因I。I基因具有独立的启动子(PI),编码一种阻遏蛋白,后者与O序列结合,使操纵子受阻遏而处于关闭状态。在启动子P上游还有一个CAP结合位点。由P序列、O序列 和CAP结合位点共同构成乳糖操纵子的调控区,三个酶的编码基因即由同一调控区调节,实现基因表达产物的协同表达。

乳糖操纵子受到阻遏蛋白和CAP的双重调节

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1、阻遏蛋白的负性调节 在没有乳糖存在时,lac操纵子处于阻遏状态。此时,I序列在PI 启动序列作用下表达的Lac阻遏蛋白与O序列结合,阻碍RNA聚合酶与P序列结合,抑制转录启动。 阻遏蛋白的阻遏作用并非绝对,偶有阻遏蛋白与0序列解聚。因此,每个细胞中可能会有寥寥数个分子的β-半乳糖苷酶、通透酶生成。
当有乳糖存在时,lac操纵子即可被诱导。在这个操纵子体系中,真正的诱导剂并非乳糖本身。 乳糖经通透酶催化、转运进入细胞,再经原先存在于细胞中的少数β-半乳糖苷酶催化,转变为别乳糖 (allolactose)。后者作为一种诱导剂分子结合阻遏蛋白,使蛋白质构象变化,导致阻遏蛋白与O序列解离而发生转录,可使β-半乳糖昔酶分子增加达1000倍。别乳糖的类似物异丙基硫代半乳糖苷(isopropylthiogalactoside, IPTG) 是一种作用极强的诱导剂,不被细菌代谢而十分稳定,因此在基因工程领域和分子生物学实验中被广泛应用。
2、CAP的正性调节 CAP是同二聚体,在其分子内有DNA结合区及cAMP结合位点。当培养基中缺乏葡萄糖时,cAMP 浓度增高,cAMP 与 CAP 结合,这时 CAP 结合在 lac启动序列附近的 CAP 位点,可刺激 RNA 聚合酶转录活性,使之提高 50 倍;当有葡萄糖存在时,cAMP 浓度降低,cAMP与CAP 结合受阻,因此 lac 操纵子表达下降。
由此可见,对 lac 操纵子来说,CAP 是正性调节因素,Lac 阻遏蛋白是负性调节因素。两种调节机制根据存在的碳源性质及水平协调调节 lac 操纵子的表达。
3、协同调节 Lac 阻遏蛋白负性调节与 CAP 正性调节两种机制协同合作: 当 Lac 阻遏蛋白阻遏转录时,CAP 对该系统不能发挥作用;但是如果没有 CAP存在来加强转录活性,即使阻遏蛋白从操纵序列上解离仍几无转录活性。可见,两种机制相辅相成、互相协调、相互制约。由于野生型lac启动子作用很弱,所以 CAP 是必不可少的。
lac 操纵子的负调节能很好地解释在单纯乳糖存在时,细菌是如何利用乳糖作为碳源的。然而,细菌生长环境是复杂的,倘若有葡萄糖或葡萄糖/乳糖共同存在时,细菌首先利用葡萄糖才是最节能的。这时,葡萄糖通过降低 cAMP 浓度,阻碍 cAMP 与 CAP 结合而抑制 lac 操纵子转录,使细菌只能利用葡萄糖。葡萄糖对lac操纵子的阻遏作用称分解代谢阻遏(catabolic repression)。lac操纵子强的诱导作用既需要乳糖存在又需要缺乏葡萄糖。

色氨酸操纵子通过阻遏作用和衰减作用抑制基因表达

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原核生物体积小,受环境影响大,在生存过程中需要最大限度减少能源消耗,对非必需氨基酸都尽量关闭其编码基因。例如,只要环境中有相应的氨基酸供应,大肠杆菌就不会自己去合成,而会将相应氨基酸的合成代谢酶编码基因全部关闭。大肠杆菌色氨酸操纵子(trp operon) 就是一个阻遏操纵子。在细胞内无色氨酸时,阻遏蛋白不能与操纵序列结合,因此色氨酸操纵子处于开放状态,结构基因得以表达。当细胞内色氨酸的浓度较高时,色氨酸作为辅阻遏物与阻遏蛋白形成复合物并结合到操纵序列上,关闭色氨酸操纵子,停止表达用于合成色氨酸的各种酶。
色氨酸操纵子的有效关闭还有一种属于促进巳经开始转录的mRNA合成终止的方式来进一步加强,这种方式称为转录衰减(transcription attenuation) , 即色氨酸操纵子还可通过转录衰减的方式抑制基因表达。这种作用是利用原核生物中转录与翻译过程偶联进行,转录时先合成的一段前导序列L来实现的。
前导序列L的结构特点是:①它可以转录生成一段长度为162bp、内含4个特殊短序列的前导mRNA;②其中序列l有独立的起始和终止密码子,可翻译成为一个有14个氨基酸残基的前导肽,它的第10位和第11位都是色氨酸残基;③序列1和序列2间、序列2和序列3间、序列3和序列4间存在一些互补序列,可分别形成发夹结构,形成发卡结构的能力依次是 1/2发夹>2/3发夹>3/4 发夹;④序列4的下游有一个连续的U序列,是一个不依赖于p因子的转录终止信号。
转录衰减的机制是:①色氨酸浓度较低时,前导肽的翻译因色氨酸量的不足而停滞在第10/11 的色氨酸密码子部位,核糖体结合在序列l上,因此前导mRNA倾向于形成 2/3 发夹结构,转录继续进行;②色氨酸浓度较高时,前导肽的翻译顺利完成,核糖体可以前进到序列2,因此发夹结构在序列3和序列4形成,连同其下游的多聚U使得转录中途终止,表现出转录的衰减。原核生物这种在色氨酸浓度高时通过阻遏作用和转录衰减机制共同关闭基因表达的方式,保证了营养物质和能量的合理利用。
前导序列发挥了随色氨酸浓度升高而降低转录的作用,故将这段序列称为衰减子(attenuator )。在trp操纵子中,阻遏蛋白对结构基因转录的负调节起到粗调的作用,而衰减子起到精调的作用。细菌中其他氨基酸合成系统的操纵子(如phe、his、leu、thr等)中也有类似的衰减调控机制。

原核基因表达在翻译水平受到精细调控

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与转录类似,翻译一般在起始和终止阶段受到调节,尤其是起始阶段。翻译起始的调节主要靠调 节分子,调节分子可直接或间接决定翻译起始位点能否为核糖体所利用。调节分子可以是蛋白质 ,也可以是RNA。

蛋白质分子结合于启动子或启动子周围进行自我调节

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无论是单顺反子还是多顺反子mRNA,许多体系应用了类似的机制,即调节蛋白结合mRNA靶位点,阻止核糖体识别翻译起始区,从而阻断翻译的机制。调节蛋白一般作用于自身mRNA,抑制自身的合成,因而这种调节方式称为自我控制(autogenous control)。细菌mRNA 起始密码子上游约10个核苷酸之前的SD序列与16和RNA 序列互补的程度以及从起始密码子AUG到嘌呤片段的距离也都强烈地影响翻译起始的效率。不同基因的mRNA有不同的SD序列,它们与16S rRNA的结合能力也不同,从而控制着单位时间内翻译过程中起始复合物形成的数目,最终控制着翻译的速度。

翻译阻遏利用蛋白质与自身mRNA的结合实现对翻译起始的调控

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翻译起始与转录 起始相类似,也受调节蛋白的作用,但与转录 不同,RNA在翻译起始过程中有重要的作用。编码区的起始点可与调节分子(蛋白质或RNA)直接或间接地结合来决定翻译起始。在此调控机制中,调节蛋白可以结合到起始密码子上,阻断与核糖体的结合。例如,S8是组成核糖体小亚基的一个蛋白质,可以与16S rRNA的茎环结构结合;L5是组成核糖体大亚基的一个蛋白质,它的mRNA的5'-末端也能形成一个与16SrRNA的茎环结构相类似的结构。因此S8也能与L5的mRNA结合。当16SrRNA含量充足时,可以与所有的S8蛋白结合,不影响L5蛋白质的合成;而当16S rRNA含量不足时,多余的S8则与L5 mRNA结合,阻遏L5蛋白质的合成,防止L5合成过量。

反义RNA利用结合mRNA翻译起始部位的互补序列调节翻译起始

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此外,在一些细菌和病毒中还存在一类调节基因,能够转录产生反义RNA(antisense RNA)。反义RNA含有与特定mRNA 翻译起始部位互补的序列,通过与mRNA杂交阻断30S小亚基对起始密码子 的识别及与SD序列的结合,抑制翻译起始。这种调节称为反义控制(antisense control)。反义RNA的调节作用具有非常重要的理论意义和实际意义。

mRNA密码子的编码频率影响翻译速度

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遗传密码表显示,除色氨酸和甲硫氨酸外,其他的氨基酸都有2个或2个以上的遗传密码子。有些是使用频率较高的常用密码子,而有些则是使用频率较低的稀有密码子。当基因中的密码子是常用密码子时,mRNA的翻译速度快,反之,mRNA的翻译速度慢。大肠杆菌dnaG基因是引物酶的编码基因,含有较多的稀有密码子,使得mRNA的翻译速度缓慢,防止引物酶合成过多。