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生物化学与分子生物学/DNA实验技术/甲基化检测原理及步骤

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DNA亚硫酸氢盐修饰设计

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使用CpGenomeTMkit使胞嘧啶转化为尿嘧啶的步骤如下。中等温度碱性pH下使DNA变性成为单链形式暴露出碱基。试剂一，一种包含亚硫酸氢根的钠盐，可使未甲基化的胞嘧啶磺化和水解脱氨，产生一种尿嘧啶磺酸盐中间产物。然后DNA在另一种盐﹙试剂二﹚存在的条件下与一种微粒载体﹙试剂三﹚结合，并通过重复离心和在70%的乙醇中重悬浮脱盐。向尿嘧啶的转化是通过在90%的乙醇中反复碱性脱磺酸基作用和脱盐完成的。DNA最终在TE缓冲液中通过加热从载体上洗脱下来。

第一步：试剂准备

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  1. 3 M NaOH原料（用前现配）：把1g干NaOH片剂溶解在8.3mL水中。使用此类腐蚀性碱，注意小心谨慎和实验操作。
  2. 20 mM NaOH/90% EtOH（用前现配）配制1mL该溶液需：900μl 100%的乙醇，93.4μl水，6.6μl 3M的氢氧化钠。
  3. 溶解试剂Ⅰ（用前现配）：打开前将试剂瓶加温至室温。对每份待修饰的样本，称取0.227g DNA修饰试剂Ⅰ加入0.571mL水中。充分涡旋振荡混合。使用该试剂时要小心谨慎，因为它对呼吸系统和皮肤有刺激性。用大约20μl 3M NaOH调整pH至5.0，用pH试纸检测pH值。试剂Ⅰ避光保存以免分解。为了最佳效果，试剂应在配置后立即使用。
  4. 溶解试剂Ⅱ：打开前将试剂瓶加温至室温。将1μl β-巯基乙醇加入20mL去离子水中。每份待修饰的DNA样本需将750μl该溶液加入到1.35g DNA修饰Ⅱ。充分混合确保完全溶解。过量的试剂可用箔纸包裹的容器、2℃-8℃、避光保存长达6周。

第二步：DNA修饰程序

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  1. 在带有螺旋形瓶盖的1.5-2.0mL的微量离心管中：将7.0μl 3M NaOH加入到含有1.0 μg DNA的100μl水中（10ng/μl），混匀。注意：如果样本含有的DNA量不到1.0μg，就向样本DNA中加入2 μl DNA修饰试剂Ⅳ并加水至总体积100μl。再加入7.0μl 3M NaOH并混匀。
  2. 50℃ DNA孵育10分钟（加热块或水浴）
  3. 加入550 μl新鲜配制的DNA修饰试剂Ⅰ并涡旋振荡。
  4. 加热块或水浴50℃避光孵育4-16小时。

第三步：初步脱盐

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  1. 强力涡旋振荡悬浮DNA修饰Ⅲ。用10x的1mL塑料移液管枪头来回吸排悬液以分散仍存在的凝块。
  2. 向含DNA溶液的管中加入5μl充分悬浮的DNA修饰试剂Ⅲ。
  3. 加入750μl DNA修饰试剂Ⅱ并充分混匀。
  4. 室温孵育5-10分钟。
  5. 5000 X g离心10秒使DNA试剂Ⅲ成颗粒状。（应出现一种白色的小颗粒。）弃去上清。
  6. 加入1.0mL 70%的乙醇，涡旋振荡，5000 X g离心10秒，弃去上清。该步骤重复进行，共3次。
  7. 将第三次上清弃去后，离心管高速离心2分钟，用塑料移液管枪头移去剩余上清。

第四步：完成DNA修饰（脱磺酸基作用），再次脱盐，并洗脱。

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  1. 适量样本加入50μl 20 mM NaOH/90% EtOH溶液。
  2. 充分涡旋振荡悬浮颗粒，再室温孵育5分钟。
  3. 5000 X g离心以移除管顶所有成分。加入1.0mL 90%的乙醇并涡旋振荡洗脱颗粒。再旋转，除去上清。再次重复该步骤。
  4. 第二次洗脱除去上清后，高速离心样本3分钟。
  5. 用塑料移液管头除去所有剩余上清。试管室温晾干10-20分钟（必须除去酒精气味）。
  6. 加入TE缓冲液。注意：加入TE的量取决于起始DNA的量和目的用途所需的加入浓度。例如，如果加入25μl TE，基于完全恢复1μg DNA的最终浓度应为40ng/μl。快速强力涡旋振荡直到颗粒完全悬浮。用手轻打或轻敲内容物至管顶（但是不要离心）。
  7. 50-60℃下样本孵育15分钟以洗脱DNA。
  8. 高速离心2-3分钟并用塑料移液管头转移样本（上清）到新管。
  9. 进行MSP或测序，或-15～-25℃可保存达2个月，-80℃可保存6个月。避免重复融化和解冻；可分量储存。不要将DNA存储在自动除霜冰箱。
  10. 当从一管中转移已解冻的DNA以备用时，避免将试剂Ⅲ转移到PCR反应管中。通常首先将管充分离心，使残留的试剂Ⅲ固体成颗粒状。

MSP

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引物合成

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运用特别设计的针对甲基化和非甲基化序列的引物，引物由生物公司合成。

甲基引物序列及扩增条件
hMLH1引物 引物序列(5’～3’) 产物长度 温度
甲基化(M) 正义 ACGTAGACGTTTTATTAGGGTCGC 115 bp 55℃
甲基化(M) 反义 CCTCATCGTAACTACCCGCG 115 bp 55℃
非甲基化(U) 正义 TTTTGATGTAGATGTTTTATTAGGGTTGT 124 bp 55℃
非甲基化(U) 反义 ACCACCTCATCATAACTACCCACA 124 bp 55℃

PCR反应条件

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  • 反应体系：10×PCR缓冲液5μl，2.5mmol/LdNTP4μl，甲基化上下游引物和去甲基化上下游引物分别为1μl，甲基化模板DNA5μl，Taq酶0.25μl，加水至总体积50μl。
循环条件
程序 温度 时间
预变性 95℃ 60 sec
变性 95℃ 30 sec
退火 55℃ 30 sec
终末延伸 72℃ 60 sec
共35个循环

PCR产物结果判定：琼脂糖凝胶电泳

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  • 甲基化阳性：甲基化特异性引物扩增出相应长度的片断，但非甲基化特异性引物未扩增出相应长度的片断，则判断基因启动子区5’CpG岛甲基化阳性。
  • 甲基化阴性：非甲基化特异性引物扩增出相应长度的片断，但甲基化特异性引物未扩增出相应长度的片断。则判断基因启动子区5’CpG岛甲基化阴性。
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