生物化学与分子生物学/DNA实验技术/基因定点突变

定点突变的目的

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把目的基因上面的一个碱基换成另外一个碱基。

定点突变的原理

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通过设计引物,并利用PCR将模板扩增出来,然后去掉模板,剩下来的就是我们的PCR产物,在PCR产物上就已经把这个点变过来了,然后再转化,筛选阳性克隆,再测序确定就行了。

引物设计原则

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引物设计的一般原则不再重复。

突变引物设计的特殊原则:

  1. 通常引物长度为25~45 bp,我们建议引物长度为30~35 bp。一般都是以要突变的碱基为中心,加上两边的一段序列,两边长度至少为11-12 bp。若两边引物太短了,很可能会造成突变实验失败,因为引物至少要11-12个bp才能与模板搭上,而这种突变PCR要求两边都能与引物搭上,所以两边最好各设至少12个bp,并且合成多一条反向互补的引物。
  2. 如果设定的引物长度为30 bp,接下来需要计算引物的Tm值,看是否达到78℃(GC含量应大于40%)。
  3. 如果Tm值低于78℃,则适当改变引物的长度以使其Tm值达到78℃(GC含量应大于40%)。
  4. 设计上下游引物时确保突变点在引物的中央位置。
  5. 最好使用经过纯化的引物。

Tm值计算公式:Tm=0.41×(% of GC)–675/L+81.5

注:L:引物碱基数;% of GC:引物GC含量。

引物设计实例

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以GCG→ACG为例:

5’-CCTCCTTCAGTATGTAGGCGACTTACTTATTGCGG-3’

  • 首先设计30 bp长的上下游引物,并将A (T)设计在引物的中央位置。

Primer #1: 5’-CCTTCAGTATGTAGACGACTTACTTATTGC-3’

Primer #2: 5’-GCAATAAGTAAGTCGTCTACATACTGAAGG-3’

  • 引物GC含量为40%,L为30,将这两个数值带入Tm值计算公式,得到其Tm=75.5(Tm=0.41×40-675/30+81.5)。通过计算可以看出其Tm低于78℃,这样的引物是不合适的,所以必须调整引物长度。
  • 重新调整引物长度。

Primer #1: 5’-CCTCCTTCAGTATGTAGACGACTTACTTATTGCGG-3’

Primer #2: 5’-CCGCAATAAGTAAGTCGTCTACATACTGAAGGAGG-3’

在引物两端加5mer(斜体下划线处),这样引物的GC含量为45.7%,L值为35,将这两个数值带入Tm值计算公式,得到其Tm为80.952(Tm=0.41×47.5-675/35+81.5),这样的引物就可以用于突变实验了。

突变所用聚合酶及Buffer

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引物和质粒都准备好后,当然就是做PCR喽,不过对于PCR的酶和buffer,不能用平时的,我们做PCR把整个质粒扩出来,延伸长度达到几个K,所以要用那些GC buffer或扩增长片段的buffer,另外,要用保真性能较好的PFU酶来扩增,防止引进新的突变。

除了使用基因定点突变试剂盒,如Stratagene和塞百盛的试剂盒,但价格昂贵。可以使用高保真的聚合酶,如博大泰克的金牌快速taq酶、Takara的PrimeSTARTM HS DNA polymerase。

如何去掉PCR产物

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最简单的方法就是用DpnI酶,DpnI能够识别甲基化位点并将其酶切,我们用的模板一般都是双链超螺旋质粒,从大肠杆菌里提出来的质粒一般都被甲基化保护起来(除非你用的是甲基化缺陷型的菌株),而PCR产物都是没有甲基化的,所以DpnI酶能够特异性地切割模板(质粒)而不会影响PCR产物,从而去掉模板留下PCR产物,所以提质粒时那些菌株一定不能是甲基化缺陷株。

DpnI处理的时间最好长一点,最少一个小时吧,最好能有两三个小时,因为如果模板处理得不干净,哪怕只有那么一点点,模板直接在平板上长出来,就会导致实验失败。

如何拿到质粒

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直接把通过DpnI处理的PCR产物拿去做转化就行了,然后再筛选出阳性克隆,并提出质粒,拿去测序,验证突变结果。

原理图示

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定点突变操作步骤

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诱导突变基因(PCR反应)

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以待突变的质粒为模板,用设计的引物及Muta-direct™酶进行PCR扩增反应,诱导目的基因突变。

设计点突变引物。 [注]参考引物设计指导

准备模板质粒DNA

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[注]用dam+型菌株(例如DH5α菌株)作为宿主菌。在end+型菌株中常有克隆数低的现象,但是对突变效率没有影响。提取质粒DNA时我们建议您使用本公司的质粒提纯试剂盒。

对照反应体系(50μl反应体系)

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50μl反应体系
10×Reaction Buffer 5μl
pUC18 control plasmid(10ng/μl,total 20ng) 2μl
Control primer mix(20pmol/μl) 2μl
dNTP mixture(each 2.5mM) 2μl
dH2O 38μl
Muta-direct™ Enzyme 1μl

样品反应体系(50μl反应体系)

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50μl反应体系
10×Reaction Buffer 5μl
Sample plasmid(10ng/μl,total 20ng) 2μl
Sample primer (F)(10pmol/μl) 1μl
Sample primer (R)(10pmol/μl) 1μl
dNTP mixture(each 2.5mM) 2μl
dH2O 38μl
Muta-direct™ Enzyme 1μl

PCR反应条件

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按如下参数设置PCR扩增条件。
Cycles Temperature Reaction Time
1cycle 95℃ 30sec
15cycle 95℃ 30sec
55℃ 1min
72℃ 1min per plasmid Kb

PCR扩增

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PCR扩增反应完成后冰育5分钟,然后置于室温(避免反复冻融)。

[注] 按下列提供的PCR条件进行扩增,控制PCR循环数。注意当突变点位点超过4个时会发生突变率降低的现象。

Mutation Cycles
1~2 Nucleotide 15 cycles
3 Nucleotides 18 cycles

突变质粒选择

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PCR反应结束后使用Mutazyme™酶消化甲基化质粒从而选择突变质粒DNA。

  1. 准备PCR反应产物
  2. 加入1μl(10U/μl)Mutazyme™酶37℃温育1小时。

[注]当质粒DNA用量过多时Mutazyme™酶可能发生与样品反应不完全的现象。因此我们建议为了保证突变率请严格遵照实验步骤进行操作。如果突变率低,可以适当延长反应时间或增加Mutazyme™酶用量。

转化

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反应完毕后在质粒DNA上会产生缺口,当把这个质粒DNA转入E.coli中时请选择dam+型菌株,例如DH5α。

  1. 将10μl样品加到50μl感受态细胞里,然后放置在冰上30分钟。
  2. 接下来可以参照一般的转化步骤进行。

序列分析

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通常当LB平板上出白色菌落则表明发生了突变。

为了证实这一结果,建议对白色单菌落进行测序分析。