生物化学与分子生物学/DNA实验技术/基因定点突变

定点突变的目的

把目的基因上面的一个碱基换成另外一个碱基。

定点突变的原理

通过设计引物，并利用PCR将模板扩增出来，然后去掉模板，剩下来的就是我们的PCR产物，在PCR产物上就已经把这个点变过来了，然后再转化，筛选阳性克隆，再测序确定就行了。

引物设计原则

引物设计的一般原则不再重复。

突变引物设计的特殊原则：

通常引物长度为25~45 bp，我们建议引物长度为30~35 bp。一般都是以要突变的碱基为中心，加上两边的一段序列，两边长度至少为11-12 bp。若两边引物太短了，很可能会造成突变实验失败，因为引物至少要11-12个bp才能与模板搭上，而这种突变PCR要求两边都能与引物搭上，所以两边最好各设至少12个bp，并且合成多一条反向互补的引物。
如果设定的引物长度为30 bp，接下来需要计算引物的Tm值，看是否达到78℃（GC含量应大于40%）。
如果Tm值低于78℃，则适当改变引物的长度以使其Tm值达到78℃（GC含量应大于40%）。
设计上下游引物时确保突变点在引物的中央位置。
最好使用经过纯化的引物。

Tm值计算公式：Tm=0.41×(% of GC)–675/L+81.5

注：L：引物碱基数；% of GC：引物GC含量。

引物设计实例

以GCG→ACG为例：

5’-CCTCCTTCAGTATGTAGGCGACTTACTTATTGCGG-3’

首先设计30 bp长的上下游引物，并将A (T)设计在引物的中央位置。

Primer #1: 5’-CCTTCAGTATGTAGACGACTTACTTATTGC-3’

Primer #2: 5’-GCAATAAGTAAGTCGTCTACATACTGAAGG-3’

引物GC含量为40%，L为30，将这两个数值带入Tm值计算公式，得到其Tm=75.5（Tm=0.41×40-675/30+81.5）。通过计算可以看出其Tm低于78℃，这样的引物是不合适的，所以必须调整引物长度。

重新调整引物长度。

Primer #1: 5’-CCTCCTTCAGTATGTAGACGACTTACTTATTGCGG-3’

Primer #2: 5’-CCGCAATAAGTAAGTCGTCTACATACTGAAGGAGG-3’

在引物两端加5mer（斜体下划线处），这样引物的GC含量为45.7%，L值为35，将这两个数值带入Tm值计算公式，得到其Tm为80.952（Tm=0.41×47.5-675/35+81.5），这样的引物就可以用于突变实验了。

突变所用聚合酶及Buffer

引物和质粒都准备好后，当然就是做PCR喽，不过对于PCR的酶和buffer，不能用平时的，我们做PCR把整个质粒扩出来，延伸长度达到几个K，所以要用那些GC buffer或扩增长片段的buffer，另外，要用保真性能较好的PFU酶来扩增，防止引进新的突变。

除了使用基因定点突变试剂盒，如Stratagene和塞百盛的试剂盒，但价格昂贵。可以使用高保真的聚合酶，如博大泰克的金牌快速taq酶、Takara的PrimeSTARTM HS DNA polymerase。

如何去掉PCR产物

最简单的方法就是用DpnI酶，DpnI能够识别甲基化位点并将其酶切，我们用的模板一般都是双链超螺旋质粒，从大肠杆菌里提出来的质粒一般都被甲基化保护起来（除非你用的是甲基化缺陷型的菌株），而PCR产物都是没有甲基化的，所以DpnI酶能够特异性地切割模板（质粒）而不会影响PCR产物，从而去掉模板留下PCR产物，所以提质粒时那些菌株一定不能是甲基化缺陷株。

DpnI处理的时间最好长一点，最少一个小时吧，最好能有两三个小时，因为如果模板处理得不干净，哪怕只有那么一点点，模板直接在平板上长出来，就会导致实验失败。

如何拿到质粒

直接把通过DpnI处理的PCR产物拿去做转化就行了，然后再筛选出阳性克隆，并提出质粒，拿去测序，验证突变结果。

原理图示

定点突变操作步骤

诱导突变基因（PCR反应）

以待突变的质粒为模板，用设计的引物及Muta-direct™酶进行PCR扩增反应，诱导目的基因突变。

设计点突变引物。 [注]参考引物设计指导

准备模板质粒DNA

[注]用dam+型菌株（例如DH5α菌株）作为宿主菌。在end+型菌株中常有克隆数低的现象，但是对突变效率没有影响。提取质粒DNA时我们建议您使用本公司的质粒提纯试剂盒。

对照反应体系（50μl反应体系）

50μl反应体系
10×Reaction Buffer	5μl
pUC18 control plasmid（10ng/μl，total 20ng）	2μl
Control primer mix（20pmol/μl）	2μl
dNTP mixture（each 2.5mM）	2μl
dH₂O	38μl
Muta-direct™ Enzyme	1μl

样品反应体系（50μl反应体系）

50μl反应体系
10×Reaction Buffer	5μl
Sample plasmid（10ng/μl，total 20ng）	2μl
Sample primer (F)（10pmol/μl）	1μl
Sample primer (R)（10pmol/μl）	1μl
dNTP mixture（each 2.5mM）	2μl
dH₂O	38μl
Muta-direct™ Enzyme	1μl

PCR反应条件

按如下参数设置PCR扩增条件。
Cycles	Temperature	Reaction Time
1cycle	95℃	30sec
15cycle	95℃	30sec
	55℃	1min
	72℃	1min per plasmid Kb

PCR扩增

PCR扩增反应完成后冰育5分钟，然后置于室温（避免反复冻融）。

[注] 按下列提供的PCR条件进行扩增，控制PCR循环数。注意当突变点位点超过4个时会发生突变率降低的现象。

Mutation	Cycles
1~2 Nucleotide	15 cycles
3 Nucleotides	18 cycles

突变质粒选择

PCR反应结束后使用Mutazyme™酶消化甲基化质粒从而选择突变质粒DNA。

准备PCR反应产物
加入1μl（10U/μl）Mutazyme™酶37℃温育1小时。

[注]当质粒DNA用量过多时Mutazyme™酶可能发生与样品反应不完全的现象。因此我们建议为了保证突变率请严格遵照实验步骤进行操作。如果突变率低，可以适当延长反应时间或增加Mutazyme™酶用量。

转化

反应完毕后在质粒DNA上会产生缺口，当把这个质粒DNA转入E.coli中时请选择dam+型菌株，例如DH5α。

将10μl样品加到50μl感受态细胞里，然后放置在冰上30分钟。
接下来可以参照一般的转化步骤进行。

序列分析

通常当LB平板上出白色菌落则表明发生了突变。

为了证实这一结果，建议对白色单菌落进行测序分析。