生物化学与分子生物学/原核生物DNA复制过程

DNA的生物合成 - DNA复制的基本规律 - DNA复制的酶学和拓扑学 - 原核生物DNA复制过程 - 真核生物DNA复制过程 - 逆转录
原核生物染色体DNA和质粒等都是共价环状闭合的DNA分子,复制过程具有共同的特点,但并非绝对相同,下面以大肠杆菌DNA复制为例,介绍原核生物DNA复制的过程和特点。

复制的起始编辑

起始是复制中较为复杂的环节,在此过程中,各种酶和蛋白质因子在 复制起点处装配引发体,形成复制叉并合成RNA引物。

DNA的解链编辑

  • 复制有固定起点 复制不是在基因组上的任何部位随机起始。E.coli上有一个固定的复制起点,称为oriC, 跨度为245bp,碱基序列分析发现这段DNA上有5组由9个碱基对组成的串联重复序列,形成Dna A结合位点,和3组由13个碱基对组成的串联重复序列的富含AT(AT rich)区。DNA双链中,AT间的配对只有2个氢键维系,故富含AT的部位容易发生解链。
  • DNA解链需多种蛋白质参与 DNA的解链过程由DnaA、DnaB 、DnaC三种蛋白质共同参与完成。DnaA蛋白是一同源四聚体,负责辨认并结合于oriC的串联重复序列(AT区) 上。 然后,几个 DnaA蛋白互相靠近,形成DNA-蛋白质复合体结构,促使 AT区的DNA解链。DnaB 蛋白(解旋酶)在 DnaC蛋白的协同下,结合并沿解链方向移动,使双链解开足够用于复制的长度,并且逐步置换出 DnaA蛋白。此时,复制叉已初步形成。

SSB(单链结合蛋白)此时结合到DNA单链上,在一定时间内使复制叉保持适当的长度,有利于核苷酸依模板掺入。

  • 解链过程中需要DNA拓扑异构酶 解链是是一种高速的反向旋转,其下游势必发生打结现象。拓扑异构酶Ⅱ通过切断、旋转和再连接的作用,实现DNA超螺旋的转型,即把正超螺旋变为负超螺旋。实验证明:负超螺旋DNA比正超螺旋有更好的模板作用。从道理上也是可以理解的:扭得不那么紧的超螺旋当然比过度扭紧的更容易解开成单链。

引物合成和起始复合物的形成编辑

复制起始过程需要先合成引物(primer) , 引物是由引物酶(primase)催化合成的短链RNA分子。
母链DNA解成单链后,不会立即按照模板序列将dNTP聚合为DNA子链。这是因为DNA poa不具备催化两个游离dNTP之间形成磷酸二酯键的能力,只能催化核酸片段的3'-OH末端与dNTP间的聚合。但RNA聚合酶不需要3'-OH便可催化NTP的聚合,而引物酶属于RNA聚合酶,故复制起始部位合成的短链引物RNA 为DNA的合成提供3'-OH末端,在DNA pol催化下逐一加入dNTP而形成DAN子链。
引物酶是复制起始时催化RNA引物合成的酶。它不同于催化转录的RNA聚合酶。利福平(rifampicin)是转录用RNA pol的特异性抑制剂,而引物酶对利福平不敏感。
在DNA双链解链基础上,形成了DnaB、DnaC蛋白与DNA复制起点相结合的复合体,此时引物酶进入。此时形成含有解旋酶DnaB、DnaC、引物酶和DNA的复制起始区域共同构成的起始复合物结构,该结构在噬菌体ΦX系统也称为引发体(primosome)。起始复合物蛋白质组分在 DNA 链上的移动需由 ATP 供给能量。 在适当位置上,引物酶依据模板的碱基序列,从5'→3'方向催化 NTP(不是dNTP) 的聚合,生成短链的 RNA 引物。
引物长度约为 5~10 个核苷酸不等。 引物合成的方向也是自 5'-端至 3'-端。 已合成的引物必然留有 3'-0H 末端,此时就可进入 DNA 的复制延长。在DNA pol Ⅲ催化下,引物末端与新配对进入的dNTP生成磷酸二酯键。新链每次反应后亦留有3'-0H, 复制就可继续进行下去。

DNA链的延长编辑

复制中DNA链的延长在DNA pol催化下进行。原核生物催化延长反应的酶是DNA pol Ⅲ。底物dNTP的α-磷酸基团与引物或延长中的子链上3'-0H反应后,dNMP的 3'-0H又成为链的末端,使下一个底物可以掺入。复制沿5'→3'延长,指的是子链合成的方向。前导链沿着5'→3'方向连续延长,而后随链沿着5'→3'方向呈不连续延长。
在同一个复制叉上,前导链的复制先于后随链,但两链是在同一个DNA pol Ⅲ催化下进行延长的。这是因为后随链的模板DNA可以折叠或绕成环状,进而与前导链正在延长的区域对齐。由于后随链作360°绕转,前导链和后随链的延长方向和延长点都处在DNA pol Ⅲ核心酶的催化位点上。解链方向就是酶的前进方向,亦即复制叉向前伸展的方向。因为复制叉上解开的模板单链走向相反,所以其中一股出现不连续复制的冈崎片段。
DNA复制延长速度相当快。以E.coli 为例,营养充足、生长条件适宜时,细菌20分钟即可繁殖一代。E.coli 基因组DNA全长约4600kb,依此计算,每秒钟能掺入的核苷酸达3800个。

复制的终止编辑

复制的终止过程,包括切除引物、填补空缺和连接切口。原核生物基因是环状DNA,复制是双向复制,从起点开始各进行180°,同时在终止点上汇合。
由于复制的半不连续性,在后随链上出现许多冈崎片段。每个冈崎片段上的引物是RNA而不是DNA。复制的完成还包括去除RNA引物和换成DNA ,最后把DNA片段连接成完整的子链。实际上此过程在子链延长中已陆续进行,不必等到最后的终止才连接。
引物的水解靠细胞核内的DNA pol I, 水解后留下空隙(gap)。空隙的填补由DNA pol I而不是DNA pol Ⅲ催化,从5'-端向3'-端用 dNTP为原料生成相当于引物长度的DNA链。dNTP的掺入要有3'-0H, 在原引物相邻的子链片段提供3'-0H继续延伸,就是说,由后复制的片段延长以填补先复制片段的引物空隙。填补至足够长度后,还是留下相邻的3'-0H和5'-P的缺口 (nick)。缺口由连接酶连接。按照这种方式,所有的冈崎片段在环状DNA上连接成完整的DNA子链。前导链也有引物水解后的空隙,在环状DNA最后复制的3'-0H端继续延长,即可填补该空隙及连接,完成基因组DNA的整个复制过程。